Phương pháp xác định quy luật sinh trưởng của virus

Tế bào Marc 145 được chuẩn bị vào đĩa 6 giếng (2×105 tế bào/giếng) và được nuôi như mô tả ở trên.

Virus PRRS được gây nhiễm lên tế bào ở MOI 0,1 (Suradhat et al., 2003). Sau một giờ ủ, để virus bám vào tế bào, huyễn dịch chứa virus được hút bỏ và môi trường nuôi dưỡng được rửa sạch một lần với 0,5ml PBS. Sau đó, dung dịch nuôi dưỡng thiết yếu được bổ sung vào môi trường nuôi cấy 100µl/giếng.

Virus được thu từ dịch nổi và phần tế bào ở các thời điểm 24 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ, 84 giờ, 96 giờ sau gây nhiễm virus.

Tiến hành xác định hiệu giá những ống virus đã thu để định lượng virus. Đường biểu diễn sự nhân lên của virus được xây dựng có biến là log10 của TCID50

tại mỗi thời điểm thu virus.

2.2.11. Phương pháp trung hòa virus (phương pháp virus cố định và huyết thanh pha loãng)

Xác định hiệu giá kháng thể trung hòa của lợn sau khi miễn dịch, các bước tiến hành như sau:

Bước 1: Chuẩn bị tế bào

- Hỗn dịch tế bào Marc145 có mật độ 5x104 tế bào/ml trong môi trường nuôi cấy tế bào MEM, 2% FBS.

- Nhỏ vào mỗi giếng 100µl hỗn dịch tế bào cho tất cả các giếng.

- Nuôi trong tủ ấm 37oC, 5% CO2 từ 1- 2 ngày để tế bào phát triển thành một lớp. Bước 2: Trung hòa virus

- Pha loãng huyết thanh cần kiểm tra thành dãy pha loãng theo cơ số 2 (1/2; 1/4; 1/8; 1/16; 1/32…) trong môi trường MEM.

- Thêm vào các ống huyết thanh đã pha một lượng tương ứng hỗn dịch virus PRRS (chủng cường độc Việt Nam VN07196) có hàm lượng virus 102TCID50/ml

- Lắc đều và ủ hỗn dịch trung hòa ở điều kiện 37oC, 5% CO2 trong 1 giờ Bước 3: Gây nhiễm trên tế bào

- Loại bỏ môi trường nuôi cấy tế bào trên đĩa 96 giếng - Rửa đĩa tế bào 1- 2 lần với PBS 1%

- Thêm 100µl hỗn dịch trung hòa ở các độ pha loãng huyết thanh vào mỗi giếng, mỗi độ pha loãng gây nhiễm cho 5 giếng tế bào Marc 145.

- Hấp phụ trong điều kiện 37oC, 5% CO2 trong 90 phút - Loại bỏ dịch hấp phụ ra khỏi đĩa tế bào

- Bổ sung vào mỗi giếng 100µl môi trường MEM, 2% FBS. Nuôi tế bào trong tủ ấm 37oC, 5% CO2 từ 48-72 giờ

Bước 4: Đọc kết quả

- Quan sát đĩa tế bào dưới kính hiển vi soi ngược để kiểm tra bệnh tích tế bào (CPE).

- Phản ứng trung hòa âm tính khi khi ở độ pha loãng huyết thanh thấy xuất hiện bệnh tích tế bào Marc 145 trên giếng (Virus không được trung hòa).

- Phản ứng trung hòa dương tính khi ở độ pha loãng huyết thanh mà không thấy xuất hiện bệnh tích tế bào Marc 145 trên giếng (Virus được trung hòa) (Yoon, 1994).

2.2.12. Phương pháp Realtime RT-PCR

Từ ARN của virus PRRS được tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Qiagen). Tiến hành chuẩn bị hỗn hợp phản ứng Realtime RT-PCR theo các thành phần như sau: Dw (Nước) 4,3µl, 2x Reaction buffer 7,5µl, Primer forward 0,3µl, Primer reverse 0,3µl, Probe 0,3µl, Enzyme mix 0,3µl, RNA mẫu 2µl. Tổng thể tích hỗn hợp phản ứng là 15µl.

Virus Primer/Probe Trình tự (5’-3’) Dye huỳnh quang

Virus PRRS

Probe (FAO) CGCGTAGAACTGTGACAACAACGCTGA Hex

Mồi xuôi (FAO) CCCAAGCTGATGACACCTTTG

Mồi ngược (FAO) AATCCAGAGGCTCATCCTGGT

Đặt hỗn hợp phản ứng vào máy Realtime PCR, chọn dye phù hợp và chạy theo chu kỳ nhiệt như sau: 50oC/15 phút, 95oC/2 phút thực hiện 1 chu kỳ và 95 oC /10 giây, 60oC/40 giây thực hiện 40 chu kỳ.

Đọc kết quả:

- Mẫu đối chứng dương cho giá trị Ct < 35. - Mẫu đối chứng âm không cho giá trị Ct.

- Mẫu là dương tính khi mẫu RNA cho giá trị Ct ≤ 35. - Mẫu nghi ngờ khi mẫu RNA cho giá trị Ct > 35. - Mẫu là âm tính khi mẫu RNA không cho giá trị Ct (TCVN 8400-21:2014).

2.2.13. Phương pháp thiết kế mồi

Thiết kế các cặp mồi khuếch đại toàn bộ hệ gen của chủng virus PRRS 02HY và Hanvet1.vn bằng RT-PCR dựa trên trình tự hệ gen của các chủng virus PRRS

genotype Bắc Mỹ lưu hành ở Việt Nam và khu vực với các số đăng ký FJ393456, FJ393457, FJ393458, FJ393459, FJ394029 và chủng vaccine nhược độc RespPRRS số đăng ký AF066183. Sử dụng phần mềm GenDoc so sánh các trình tự hệ gen toàn phần của virus PRRS lưu hành ở Việt Nam với trình tự hệ gen toàn phần của chủng virus PRRS 02HY. Dựa vào những vùng bảo thủ trong hệ gen để thiết kế 15 cặp mồi khuếch đại 15 đoạn (mỗi đoạn khoảng 1 kb) toàn bộ hệ gen (Bảng 2.1).

Bảng 2.1. Các cặp mồi dùng trong khuếch đại 15 đoạn gen của hệ gen chủng virus PRRS 02HY và Hanvet1.vn

TT Tên mồi Trình tự (5’-3’) Độ dài (Nucleotide) Tm ước tính (oC) Sản phẩm PCR (bp) 1 PRRSP1 CGTATAGGTGTTGGCTCTATGC 22 50 1.124 PRRSM1 ATTAACTTGCAGCCTCCGC 19 2 PRRSP2 ACACTGTCCCTGAAGGCAACTGC 23 55 1.244 PRRSM2 CCCAGGGAGCACAACATCCC 20 3 PRRSP3 AACAAAACCAACCGGGTCACCC 22 56 1.217 PRRSM3 CCGCCCGAGTCGATGATGG 19 4 PRRSP4 GCTTCCTCACAGACTGAATATGAGG 25 53 1.105 PRRSM4 CTGGCGAGTCAAACTCACAAGC 22 5 PRRSP5 TGGCTGCTGGTTGGCTTTTGC 21 57 1.031 PRRSM5 GTTGGGAAATGCACAATCTGGACG 24 6 PRRSP6 GTGCGCTAACCCGTTTGCCG 20 57 1.041 PRRSM6 GCCACATTACAAAACTGGCCTGAGG 25 7 PRRSP7 CTTGTCGGCGTTCACACGGG 20 56 896 PRRSM7 GCTGCATTCCTCATGTTGGACG 22 8 PRRSP8 CCCTCGCTATGAGACTCAATGACG 24 56 1.238 PRRSM8 CTTTAGTGGCTTCGGACTCAAAATCC 26 9 PRRSP9 TGATGCATCTCCCAAGTTACTTGC 24 54 1.093 PRRSM9 CAGGCCACCTCTCTTAGTCACTGC 24 10 PRRSP10 ATCCACGCCTGCAATTGTCC 20 54 1.189 PRRSM10 GGTGGGCCGATGATGAACC 19 11 PRRSP11 GCCTTGCTCCCTACCTGCAAAG 22 56 1.115 PRRSM11 GCAACCAGCCGATCTGGCC 19 12 PRRSP12 GCTAAACTCCCAGTAGAACTTGC 23 50 1.164

TT Tên mồi Trình tự (5’-3’) Độ dài (Nucleotide) Tm ước tính (oC) Sản phẩm PCR (bp) PRRSM12 AAGAATATGATGATATCAACAATGG 25 13 PRRSP13 TTACAAAATTGGCCAACTTTTTGTGG 26 56 955 PRRSM13 CCGTGTAGCTGAAGGACAAGAACG 24 14 PRRSP14 GGGTTTATGATACCGCCTGG 20 50 1.267 PRRSM14 CCAGAAGAAAGTTGGTATATCTGG 24 15 PRRSP15 CATTTACAGTTGATTTATAACTTAACG 27 48 1.472 PRRSM15 GGTCGCCCTAATTGAATAGG 20 2.2.14. Phương pháp RT-PCR

ARN tổng số được tách chiết từ dịch tế bào Marc 145 chứa virus bằng phương pháp Trizol. Nồng độ ARN được xác định bằng máy NanoDrop. ARN được chuyển sang cADN bằng enzyme phiên mã ngược Super ScriptTMII Reverse transcriptase (Fermentas) ở nhiệt độ 50oC trong 30 phút và tiền biến tính ở nhiệt độ 94oC trong 2 phút. Tổng hợp ADN sợi kép bằng enzyme Platinum Taq DNA polymerase dựa trên sợi khuôn là cADN. Phản ứng PCR được tiến hành để khuếch đại các phân đoạn khác nhau của hệ gen virus PRRS với mỗi cặp mồi tương ứng và chu kỳ nhiệt thích hợp là 94oC/3 phút (94oC/15 giây, 50oC/50 giây, 72oC/1 phút 30 giây), lặp lại 30 chu kỳ như trên, 72oC/8 phút, 4 oC-.

2.2.15. Phương pháp tách dòng và giải trình tự gen

Sản phẩm PCR được tạo dòng bằng cách gắn trực tiếp vào vectơ tách dòng pCR 2.1 với việc sử dụng bộ TA cloning Kit của hãng Invitrogen theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó, sản phẩm gắn được biến nạp vào tế bào E. coli chủngTop 10F‘ bằng phương pháp sốc nhiệt. Plasmid chứa các phân đoạn gen được tách chiết từ các khuẩn lạc trắng và kiểm tra các đoạn gen chèn bằng cắt với enzyme hạn chế

EcoRI. Tinh sạch plasmid tái tổ hợp để phục vụ cho việc giải trình tự gen được thực

hiện bằng bộ KIT S.N.A.P Miniprep Kit của hãng Fermentase. Phản ứng xác định trình tự được thực hiện nhờ bộ kit BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit của hãng Applied Biosystems, sử dụng hai mồi xuôi và ngược M13F và M13R. Xác định trình tự tự động trên hệ thống ABI 3100, phân tích trình tự bằng phần mềm BioEdit và DNA Star.

2.2.16. Phương pháp so sánh trình tự gen và tạo cây phả hệ

Trình tự nucleotide và protein vùng ORF5 mã hóa kháng nguyên GP5 của virus PRRS 02HY cường độc và Hanvet1.vn nhược độc, các chủng virus PRRS lưu hành ở các tỉnh thành trong nước và khu vực được thu nhận từ Ngân Hàng gen NCBI (được thống kê trong bảng phần Phụ lục). Trình tự nucleotide và protein được so sánh bằng chương trình phần mềm BioEdit sau đó xây dựng cây phả hệ bằng phần mềm MEGA6 sử dụng thuật toán Neighbor-Joining.

2.2.17. Phương pháp điện di

Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel

Dung dịch đệm được sử dụng là TAE và agarose để tạo bản gel.

Chuẩn bị bản gel bằng dung dịch đệm TAE 1X hòa tan với 1,5 gam agarose đặt trong lò vi sóng ở 100oC trong 5 phút, đổ vào khuôn có các lược được cài sẵn để tạo bản gel có các giếng tra mẫu. Khi bản gel đã đông đặt bản gel vào bể điện di và đổ dung dịch đệm TAE ngập bản gel khoảng 3-5mm.

Bước 2: Tra mẫu điện di

Thêm 2l loading dye vào 8l sản phẩm RT-PCR, trộn đều hỗn dịch bằng pipet và chuyển vào các giếng trong bản gel. Điện di đồng thời cả thang chuẩn ADN (marker), thường sử dụng 4-6l ADN marker.

Bước 3: Chạy điện di

Nguồn điện trong điện di sử dụng ở hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian chạy điện di trong 30 phút.

Bước 4: Nhuộm bản gel và đọc kết quả

Kết thúc điện di, bản gel được lấy ra nhuộm Ethidium bromide trong khoảng 5 đến 7 phút. Sau khi nhuộm bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quả điện di. Vị trí các đoạn ADN được phát hiện bằng những vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và lưu kết quả.

2.2.18. Phương pháp IPMA xác định hiệu giá kháng thể

Chuẩn bị:

- Môi trường phát triển tế bào MEM với 5%FCS

- Dung dịch A: Dung dịch cố định tế bào, gồm PBS có 10% Formalin và 1% NP40.

- Dung dịch B: Dung dịch nước rửa, gồm PBS với 1% Tween 80.

- Dung dịch C: Dung dịch pha loãng mẫu, gồm PBS với 1% Tween 80 và 5% sữa gầy.

- Dung dịch E: Dung dịch AEC, gồm 1ml dung dịch AEC nguyên chất và 14ml dung dịch đệm axetat 0,1M (pH 5,2) sau đó thêm 15µl H2O2 30%.

- Tế bào Marc 145 một lớp.

- Giống virus chuẩn PRRS VN07196.

 Các bước tiến hành:

Bước 1: Chuẩn bị tế bào Marc 145 một lớp trên đĩa 96 giếng với nồng độ 5x104 tế bào/ml.

Bước 2: Nhiễm virus PRRS chuẩn với liều 500TCID50/ml, 100µl/ giếng. Ủ đĩa từ 1-2 ngày trong tủ ấm 37 oC, 5% CO2.

Bước 3: Cố định tế bào đã nhiễm virus + Bỏ môi trường duy trì tế bào trong đĩa + Cho 100µl dung dịch A vào mỗi giếng + Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

+ Đổ bỏ dung dịch A, rửa đĩa 2 lần bằng dung dịch B Bước 4: Gắn mẫu cần kiểm tra

+ Pha loãng huyết thanh theo cơ số 2, huyết thanh đối chứng dương.

+ Chuyển 50µl huyết thanh đã pha loãng ở các nồng độ khác nhau vào các giếng. + Ủ đĩa ở 37oC trong 30 phút.

+ Đổ bỏ dung dịch trong đĩa, rồi rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch B.

Bước 5: Gắn kháng kháng thể PRRS có gắn enzyme (conjugate + peroxidase) (kháng thể này được chế trên thỏ)

+ Pha loãng conjugate trong dung dịch B theo tỷ lệ 1/600. + Nhỏ 50µl conjugate đã pha loãng vào các giếng.

+ Ủ đĩa 37 oC trong 30 phút

+ Đổ bỏ dung dịch trong đĩa, rồi rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch B. Bước 6: Cho cơ chất

+ Ủ đĩa ở nhiệt độ 25oC trong 30 phút.

- Bước 7: Đọc kết quả dưới kính hiển vi soi ngược

+ Nếu quan sát thấy thảm tế bào trong giếng có những đám tế bào bắt màu đỏ đậm thì mẫu huyết thanh cho vào giếng đó dương tính với kháng thể PRRS.

+ Nếu quan sát thấy toàn bộ thảm tế bào trong giếng có màu hồng nhạt là màu của môi trường MEM thì mẫu huyết thanh cho vào giếng đó âm tính với kháng thể PRRS (TCVN 8400-21:2014).

2.2.19. Phương pháp đếm tế bào Marc 145

Sử dụng buồng đếm Newbauer cải tiến, chuẩn bị buồng đếm tế bào. Hút 100µl huyễn dịch tế bào trộn đều với 100µl thuốc nhuộm tế bào Trepan blue nhỏ vào buồng đếm. Đếm tổng số tế bào ở 4 góc và tính số lượng tế bào trong 1ml huyễn dịch. Công thức: [Tổng số tế bào đếm được ở 4 góc/4]*2*104

(Alan D et al,. 1999).

2.2.20. Phương pháp kiểm tra vô trùng thuần khiết và an toàn của virus giống gốc

+ Kiểm tra vô trùng (TCVN 8684-2011) Kiểm tra tạp nhiễm vi khuẩn

Tiến hành cấy mẫu giống gốc Hanvet1.vn trên 2 ống môi trường kiểm tra sau đây: Môi trường Thioglycollat, môi trường Trypticaza đậu tương, 2 đĩa môi trường Thạch máu, lượng mẫu cấy từ 1% đến 2% (phần thể tích) so với môi trường kiểm tra.

Ủ môi trường đã cấy trong tủ 37oC, theo dõi từ 7 ngày đến 10 ngày.

Mẫu giống gốc đạt tiêu chuẩn khi không có vi sinh vật mọc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.

Kiểm tra tạp nhiễm nấm mốc

Mẫu giống gốc Hanvet1.vn được ria cấy trên môi trường thạch Sabouraud. Theo dõi 14 ngày ở nhiệt độ phòng (từ 20oC đến 25oC). Mẫu đạt tiêu chuẩn khi không có nấm mốc trên môi trường kiểm tra trong thời gian theo dõi.

+ Kiểm tra tính thuần khiết

Sử dụng kỹ thuật PCR/RT PCR phát hiện các loại virus Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), Transmissible gastroenteritis virus (TGEV), Classical swine fever virus (CSFV), Porcine circovirus type 2 (PCV2), Porcine parvovirus (PPV),

sau đó điện di sản phẩm để kiểm tra so sánh với đối chứng dương chuẩn, đối chứng âm và marker DNA/cDNA để xác định kết quả.

+ Kiểm tra chỉ tiêu an toàn

Tiêm bắp sau vành tai cho 04 lợn 5 tuần tuổi với liều 106TCID50 giống gốc Hanvet1.vn nhược độc, sau 7 ngày lấy máu 04 lợn, mỗi con 1ml tiêm truyền tiếp sang 04 lợn khác. Quá trình tiếp truyền được tiến hành lặp lại liên tục 5 đời lợn (đời 01 đến đời 05). Theo dõi lợn trong suốt quá trình thí nghiệm, nếu tất cả lợn sống khỏe mạnh, không có bất cứ phản ứng cục bộ hay toàn thân nào (lợn có thể có phản ứng sốt nhẹ, tăng 0,5oC) thì giống gốc vaccine đạt chỉ tiêu an toàn.

2.2.21. Phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch trên lợn với vaccine Hanvet1.vn

Lợn con 4 tuần tuổi, đồng đều về giống, tình trạng sức khoẻ, điều kiện chăn nuôi và vệ sinh thú y. Phân chia ngẫu nhiên số lợn trên vào các nhóm, sử dụng vaccine Hanvet1.vn được chế tạo từ giống gốc Hanvet1.vn nhược độc cho các nhóm với liều tiêm bắp như nhau. Theo dõi và xác định hiệu giá kháng thể sau khi tiêm vaccine. Đánh giá sự hình thành đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch sau khi tiêm vaccine bằng lấy máu lợn tại các thời điểm sau tiêm vaccine 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 tuần để xác định hiệu giá kháng thể bằng IPMA và lấy máu lợn tại các thời điểm sau tiêm vaccine 2, 3, 4, 5, 6 tháng để xác định hiệu giá kháng thể trung hòa. Để đánh giá khả năng bảo hộ của vaccine với chủng virus cường độc, tiêm vaccine cho 12 lợn 4 tuần tuổi có huyết thanh âm tính với kháng thể PRRS. Sau tiêm 28 ngày, lấy máu 12 lợn được miễn dịch (lô thí nghiệm) và 4 lợn không tiêm vaccine (lô đối chứng) để kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phản ứng IPMA và phản ứng trung hòa trên tế bào. Sau đó lợn thí nghiệm và đối chứng được thử thách với chủng virus PRRS cường độc VN07196 Việt Nam với liều 106TCID50. Sau khi công cường độc, theo dõi các biểu hiện lâm sàng, thân nhiệt, khả năng tăng trọng, đồng thời lấy máu lợn ở các thời điểm 3, 5, 7, 10, 14, 21 ngày sau khi công cường độc để phân lập, xác định virus huyết và mổ khám xác định bệnh tích (Yu et al,. 2015).

2.3.22. Phương pháp thống kê, xử lý số liệu

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Xác định sự tương đồng về nucleotide của phân đoạn gen thu được trong nghiên cứu bằng phần mềm Bioedit version 7.2.5. Xác định nguồn gốc phát sinh chủng loại trên cơ sở trình tự gen của chủng virus thu nhận được bằng phần mềm MEGA version 6.0. Các số liệu được xử lý trên phần mềm Excel 2010, sử dụng phương pháp thống kê sinh học, Minitab 16.

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Nghiên cứu đánh giá độc lực và đặc tính sinh học 2 chủng virus PRRS 02HY và 05TB 02HY và 05TB

Thực nghiệm gây nhiễm 02 chủng virus PRRS 02HY và 05TB trên lợn để kiểm tra độc lực và các đặc tính sinh học của 2 chủng PRRS thông qua đánh giá khả năng gây bệnh tích điển hình, đặc trưng, các biểu hiện triệu chứng lâm sàng, chỉ số virus huyết, khả năng kích thích sinh kháng thể miễn dịch của lợn, khả năng gây bệnh tích tế bào, khả năng nhân lên, thích ứng của virus PRRS trên môi trường tế bào Marc