- Bước 6: Ủ mẫu ở nhiệt độ 560C trong 10 phút.
2.4.4.2.PCR xác định tính đa hình của gen coagulase (theo qui trình của Goh và cộng sự) [50]
Goh và cộng sự) [50]
4 loại primer: COAG1:5’-ATACTCAACCGACGACACCG-3’ COAG2: 5’-CGAGACCAAGATTCAACAAG-3’ COAG3: 5’-AAAGAAAACCACTCACATCA-3’
COAG4: 5’-GATTTTGGATGAAGCGGATT-3’
COAG1: trình tự mồi của gen coagulase ở vị trí nucleotide 1362 đến 1381 COAG2: trình tự mồi của gen coagulase ở vị trí nucleotide 1632 đến 1651 COAG3: trình tự mồi của gen coagulase ở vị trí nucleotide 2589 đến 2608 COAG4: trình tự mồi của gen coagulase ở vị trí nucleotide 2859 đến 2878
+ Quy trình PCR vòng 1: Các thành phần cho 1 phản ứng:
PCR master mix (x2) 12,5 µl Primer 1 COAG 1 (12,5 µM) 2,0 µl Primer 2 COAG 4 (12,5 µM) 2,0 µl DNA template 2,0 µl Thể tích cuối cùng 25,0 µl Chu kỳ nhiệt: 950C trong 5 phút 950C trong 30 giây 550C trong 2 phút 40 chu kỳ 720C trong 4 phút 720C trong 7 phút Giữ ở 40C + Quy trình PCR vòng 2 Các thành phần cho 1 phản ứng: Nước cất cho PCR 7,5 µl PCR master mix (x2) 12,5 µl Primer 1 COAG 2 (12,5 µM) 2,0 µl Primer 2 COAG 3 (12,5 µM) 2,0 µl DNA template (sản phẩm của vòng 1) 1,0 µl
Thể tích cuối cùng 25,0 µl Chu kỳ nhiệt: 950C trong 5 phút 950C trong 30 giây 550C trong 2 phút 40 chu kỳ 720C trong 4 phút 720C trong 7 phút Giữ ở 40C
+ Điện di sản phẩm lần 1 và lần 2 để kiểm tra
- Điện di các sản phẩm sau khi chạy PCR trên gel agarose 1,5% (100 ml dung dịch TAE cho 1,5 g thạch agarose) với dung dịch đệm là TAE.
- Chuẩn bị gel agarose 1,5 %: Đun sôi cho tan hoàn toàn agarose trong đệm TAE bằng lò vi sóng. Đợi nhiệt độ gel hạ xuống 56-600C, đổ gel vào khay nhựa điện di (6 x 5,5 cm hoặc 6 x 11 cm tuỳ theo số lượng mẫu cần điện di). Khay được đặt thăng bằng trên mặt phẳng nằm ngang đã đặt sẵn lược.
- Để gel đông lại (khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng), gỡ bỏ lược, đặt bản gel vào buồng điện di ngang sao cho chìm hẳn trong dung dịch đệm TAE.
- Dùng micropipette cho các sản phẩm PCR vào các giếng của bản gel. Với các gel sử dụng răng lược nhỏ, dùng 10 µl sản phẩm PCR trộn đều với 2 µl loading dye.
- Điện di với hiệu điện thế 120V, cường độ dòng điện 100 mA trong thời gian 30 phút.
- Các mẫu thực nghiệm được điện di song song cùng với chứng. - Luôn có thang DNA chuẩn để đối chiếu kết quả khi đọc. + Nhuộm DNA và đọc kết quả
- Bản gel sau khi điện di được ngâm trong dung dịch ethidium bromide 1% pha trong nước cất (trong 10 phút), sau đó vớt bản gel ra ngâm vào nước cất 10 phút để khử ethidium bromide bám không đặc hiệu vào thạch. Sau khi nhuộm, các vạch DNA trên bản gel sẽ phát sáng dưới ánh đèn cực tím.
- Đọc kết quả bằng máy GelDoc (BioRad) với phần mềm chuyên dụng. Chụp ảnh nếu có sản phẩm phù hợp.
+ Đo nồng độ DNA sản phẩm PCR 2
Đo mật độ sản phẩm PCR 2 bằng máy Spectrophotometer (Eppendorf, Đức)
Tính ra nồng độ bằng ng/µl (nồng độ tối thiểu phải từ 10-50 ng/µl) + Cắt bằng enzyme AluI
Các thành phần tham gia phản ứng cắt như sau (theo quy trình của nhà sản xuất): - Sản phẩm PCR vòng 2 10 µl - Nước cất PCR 18 µl - 10x Buffer 2 µl - AluI 1,5 µl
Trộn thật đều bằng pipette với đầu tip 10 µl, không để dính lên thành, nếu dính thì ly tâm nhanh trong vòng 20 giây.
Để ở 370C trong 10 giờ (dùng block nhiệt) cho ổn định, phải theo dõi nhiệt độ liên tục, không để mất điện
+ Điện di trên agarose 1,5% + Soi và chụp ảnh
+ Tiêu chuẩn phân loại S. aureus dựa vào tính đa hình của gen mã hóa
coagulase (theo nghiên cứu của Goh [50] và Su [113]). Các genotype của S. aureus được xác định dựa vào:
- Kích cỡ của băng DNA được cắt bằng enzyme AluI
- Số lượng các đoạn DNA sau khi cắt