- Nguyên lý của phản ứng PCR: Dựa theo sự sao chép theo cơ chế
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4.2. Phân lập, xác định S aureus
Hình 2.1: Sơ đồ phân lập, xác định S. aureus
Mẫu tăm bông lấy ở mũi và tay được nuôi cấy, phân lập riêng biệt theo thường qui vi sinh và được cải tiến dựa vào nghiên cứu của Nouwen và cộng sự [90]. Tóm tắt qui trình như sau:
+ Mỗi tăm bông lấy mẫu được ria thành 3 vùng lên 1 đĩa thạch máu. Đĩa thạch máu để ở điều kiện 370C trong 18 - 24 giờ.
+ Trên thạch máu chọn khuẩn lạc nghi ngờ đục dạng S (tròn, lồi, nhẵn, bóng), có sắc tố hoặc không, có vòng tan huyết hoặc không.
+ Làm tiêu bản nhuộm Gram, nếu soi thấy có hình ảnh cầu khuẩn bắt màu Gram dương xếp thành từng đám thì tiếp tục làm các phản ứng sinh vật hóa học để xác định S. aureus.
- Lên men đường Manitol: Trên môi trường Chapman sau 24 - 48h
S. aureus sẽ làm cho màu của môi trường chuyển từ đỏ sang vàng. Tức là có khả năng lên men đường manitol.
- Xác định sự có mặt của men coagulase:
+ Coagulase liên kết trên phiến kính: Nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên phiến kính. Lấy vi khuẩn nghi ngờ nghiền đều: nếu không thấy hiện tượng ngưng kết (nghĩa là, vi khuẩn không tự ngưng kết) thì nhỏ thêm một giọt huyết tương thỏ lắc đều. Trong vòng 5 giây, nếu thấy vi khuẩn tụ lại thành các hạt nhỏ là coagulase liên kết dương tính. Nếu không có gì thay đổi là coagulase liên kết âm tính. Những trường hợp âm tính phải kiểm tra lại bằng kỹ thuật xác định coagulase tự do.
+ Coagulase tự do:
Dùng nước muối sinh lý, pha loãng huyết tương thỏ thành ¼
Nhỏ vào 3 ống nghiệm vô trùng, mỗi ống 0,5ml huyết tương đã pha loãng
Dùng que cấy lấy tụ cầu mẫu (chủng ATCC 25923) cho vào ống thứ nhất, ống thứ hai để nguyên làm chứng, ống thứ ba cho tụ cầu cần thử. Ủ các ống nghiệm trên ở 37oC
Đọc kết quả: Sau khi ủ 6 giờ (nếu để quá lâu thì kết quả có thể trở thành âm tính giả, vì nhiều chủng tụ cầu tiết men fibrinolysin làm lỏng huyết tương trước đó đã đông), nếu huyết tương đông lại như một cục thạch, dốc ống nghiệm lên vẫn không rơi (đông hoàn toàn) hoặc nghiêng ống nghiệm nhìn thấy có cục đông, xung quanh còn một ít huyết tương không đông (đông không hoàn toàn) thì gọi là coagulase dương tính. Một trong bốn
trường hợp sau đây có thể xảy ra trong khi đọc kết quả thử nghiệm này:
Trường hợp 1: Ở ống 1 và ống 3, huyết tương đông; ống 2, huyết tương không đông: coagulase dương tính.
Trường hợp 2: Ở ống 1 huyết tương đông, ống 2 và 3 huyết tương không đông: coagulase âm tính. Để thêm đến 24 giờ ở nhiệt độ phòng, nếu kết quả vẫn không thay đổi thì kết quả là âm tính thực sự.
Trường hợp 3: Ở cả 3 ống, huyết tương đều đông: huyết tương đã hỏng, phải làm lại bằng huyết tương mới.
Trường hợp 4: Ở cả 3 ống, huyết tương đều không đông: tụ cầu mẫu hoặc huyết tương đã hỏng hoặc là hỏng cả hai. Phải kiểm tra riêng rẽ từng yếu tố và làm lại thử nghiệm.
- Kỹ thuật xác định catalase: Dùng que vô trùng (không phải là kim loại) lấy một lượng vi khuẩn từ khuẩn lạc cần xác định S. aureus (được nuôi cấy trên môi trường thạch thường sau 18-24 giờ) lên lam kính. Nhỏ 1 giọt dung dịch H2O2 3% lên trên vi khuẩn ở lam kính và quan sát, nếu thấy hiện tượng sủi bọt khí (tạo ra O2): catalase dương tính; không thấy hiện tượng sủi bọt khí: catalase âm tính.
- Các tính chất chính đã được xác định S. aureus [5], [44]. + Cầu khuẩn Gram dương xếp thành từng đám.
+ Có men coagulase. + Có men catalase
+ Lên men đường manit.
- Tiêu chuẩn xác định S. aureus: âm tính
Sau 96 giờ nuôi cấy nếu không thấy khuẩn lạc có tính chất trên xuất hiện. Mẫu xét nghiệm được coi là âm tính với S. aureus.