Chúng tôi đã chọn kỹ thuật giải trình tự trực tiếp (direct sequencing) sản phẩm PCR, sử dụng ph−ơng pháp đánh dấu nucleotit kết thúc chuỗi bằng chất huỳnh quang. Kỹ thuật giải trình tự trực tiếp có hiệu quả kinh tế cao, đồng thời tránh đ−ợc tỷ lệ đột biến soma cao của gen ty thể (Đặng Tất Thế và cộng sự, 2004)[25][26].
Phản ứng giải trình tự chu kỳ nhiệt (Thermal cycle sequencing) đ−ợc tiến hành với bộ hóa chất FS-DNA sequencing kit (Perkin Elmer, Mỹ) và thực hiện trên máy chu trình nhiệt (iCycler BioRad, Mỹ) (hình PL6.8A, phụ lục 6), thành phần hỗn hợp và chu kỳ nhiệt của phản ứng theo h−ớng dẫn của nhà sản xuất kit.
Sản phẩm của phản ứng giải trình tự đ−ợc tinh chế để loại bỏ các thành phần khác trong hỗn hợp phản ứng, bằng cách lọc qua Sephadex G-50 (Amersham Biosciences, Mỹ) nhồi trong cột ly tâm Centri-SepTM spin column (Princeton Separations, Mỹ) và tiến hành theo qui trình của nhà sản xuất FS- ADN sequencing kit. Sản phẩm sau khi tinh chế đ−ợc sấy khô bằng ly tâm chân không 1.500 vòng/ phút, tại nhiệt độ 45 - 600C và bảo quản ở nhiệt độ - 200 C hoặc - 800 C tr−ớc khi sử dụng.
Sản phẩm của phản ứng giải trình tự đã tinh chế đ−ợc điện di trên bản thạch biến tính polyacrylamide 4,5%, đọc điện di và giải mã trình tự bằng
máy tự động ABI-377 PRISM (Perkin Elmer, Mỹ) (hình PL6.8C, phụ lục 6). Các đoạn ADN đích đều đ−ợc giải trình tự sợi đôi, nhằm thu đ−ợc trình tự có độ chính xác cao.
Sử dụng các ch−ơng trình máy tính Factura, Autoassemble, Sequence Navigator (Perkin Elmer, Mỹ) và để lắp ráp và xác định trình tự cho từng mẫu, cũng nh− đối chiếu trình tự giữa các mẫu.
2.3.3 Phân loại ong nội mức d−ới loài dựa trên kết quả phân tích hình thái, sinh học phân tử (ADN ty thể) thái, sinh học phân tử (ADN ty thể)
2.3.3.1 Ph−ơng pháp thu thập và xử lý số liệu hình thái
- Tiêu bản của các chỉ tiêu hình thái đ−ợc đ−a lên máy chụp hình và tiến hành đo đếm ngay trên máy. Toàn bộ số liệu của các chỉ tiêu tự động nhập vào máy, có một số chỉ tiêu phải đo ở kính hiển vi soi nổi đ−ợc nhập vào máy bằng tay. Tính các giá trị thống kê nh−: giá trị trung bình, sai số của các chỉ tiêu phân tích ở mỗi vùng nghiên cứu theo ph−ơng pháp thống kê sinh học theo ch−ơng trình Microsoft Excel 2000 (data analysis-descriptive statistics).
- Tính giá trị trung bình của từng chỉ tiêu hình thái của các quần thể ong nghiên cứu đ−ợc xếp hạng từ 1 trở đi theo thứ tự từ lớn đến bé (ví dụ: khu vực nghiên cứu có 7 điểm thì gía trị xếp hạng của từng chỉ tiêu sẽ là từ 7-1, hạng 7 cho giá trị chỉ tiêu lớn nhất). Giá trị trung bình của mỗi nhóm ong bằng tổng số giá trị xếp hạng của tất cả các chỉ tiêu trong nhóm đó chia cho số chỉ tiêu đ−ợc xếp hạng. Nh− vậy, nhóm ong có giá trị các chỉ tiêu đo đếm cao nhất thì có giá trị trung bình xếp hạng lớn nhất và ng−ợc lại. Nếu đánh thứ tự xếp hạng ng−ợc lại thì phải phân tích ng−ợc lại.
- Để tìm hiểu sự khác biệt hình thái ong mật Apis cerana giữa các điểm điều tra của khu vực nghiên cứu, chúng tôi sử dụng phần mềm thống kê
Statistica 6.0, ch−ơng trình phân tích sai khác phân biệt giữa các quần thể ong của các khu vực nghiên cứu bằng 2 công cụ:
o Xử lý số liệu d−ới dạng đồ thị hình elip với độ tin cậy của elip là 75% đ−ợc thực hiện bởi công cụ (Module) phân tích phân biệt (Discriminant analysis). Nếu các hình elip tách biệt khỏi nhau, có nghĩa là các nhóm ong nghiên cứu khác biệt rõ ràng về hình thái và ng−ợc lại (máy tự động phân tích và vẽ đồ thị).
o Xử lý số liệu bằng công cụ phân tích nhóm và phân loại (Cluster analysis and classification) để phân nhóm các quần thể ong của vùng nghiên cứu (máy tự động phân tích và đ−a ra mô hình khoảng cách liên kết hay khoảng cách phân loại học dựa trên cách tính khoảng cách Euclid).
2.3.3.2 Ph−ơng pháp phân tích số liệu của sinh học phân tử (ADN ty thể)
Sử dụng ch−ơng trình phần mềm máy tính Clustal X, version 1.81 và MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis), version 3.1 để xử lý và phân tích các bộ số liệu trình tự, chủ yếu là tính toán các đặc điểm thống kê, xây dựng cây phát sinh chủng loại và phân tích sự đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể (Hall B. G., 2001[57]; Kumar S. et al., 2004 [62]).
Sử dụng các ph−ơng pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại (neighbor joining - NJ), maximum parsimony (MP) và maximum likelihood (ML) (Đặng Tất Thế, 2005)[27]. Các ph−ơng pháp này đại diện cho 3 nhóm ph−ơng pháp chính đang đ−ợc sử dụng phổ biến nhất hiện nay là ph−ơng pháp khoảng cách (distance method), ph−ơng pháp tối đa (maximum parsimony method) và ph−ơng pháp xác suất lớn nhất (maximum likelihood method) (Kumar S. et al., 2004[62]).
Khoảng cách di truyền theo mô hình 2 thông số đã đ−ợc sử dụng cho ph−ơng pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại trên cơ sở khoảng cách tiến hóa. Các vị trí có nucleotit bị mất hoặc bị sự chèn, xoá đều đ−ợc loại bỏ, trừ
ph−ơng pháp MP sử dụng toàn bộ các vị trí. Chỉ số CI (consistensy index) đ−ợc tính toán trong khi xây dựng cây phát sinh chủng loại theo ph−ơng pháp MP trong ch−ơng trình PAUP.
Các công thức toán học và qui trình xây dựng cây phát sinh chủng loại theo ph−ơng pháp NJ, MP, ML đã đ−ợc mô tả và h−ớng dẫn trong ch−ơng trình phần mềm máy tính MEGA3, PAUP 4.0b2 và tài liệu tham khảo của Hall B. G., 2001[57].
2.3.4 H−ớng sử dụng nguồn gen vào công tác giống và bảo tồn
Dựa trên kết quả phân tích số liệu hình thái và sinh học phân tử (ADN ty thể), kết hợp với số liệu của một số chỉ tiêu sinh học đ−ợc điều tra sơ bộ sẽ là cơ sở khoa học tốt cho việc đề xuất h−ớng sử dụng nguồn gen ong mật Apis
cerana vào công tác giống và bảo tồn. Một số chỉ tiêu sinh học đ−ợc điều tra thu thập (chỉ mang tính tham khảo) là:
- Năng suất mật là tính trạng do nhiều gen quy định (Laidlaw H. H. and Page R. E., 1997)[69]. Hơn nữa năng suất mật phụ thuộc rất nhiều yếu tố nh− nguồn hoa, hình thức nuôi, kỹ thuật chăm sóc-phòng trị bệnh, thế đàn (tập tính xã hội) và hình thức khai thác mật. Thu thập số liệu bằng cách điều tra phỏng vấn.
- Sức đẻ trứng của ong chúa đ−ợc đo theo số l−ợng ô nhộng (Phùng Hữu Chính, 1996)[5]. Khó khăn của việc thu thập số liệu này là nếu nh− ong đ−ợc nuôi bằng hình thức cổ truyền thì không thể đo đếm đ−ợc mà chỉ thực hiện đối với hình thức nuôi hiện đại.
Ch−ơng 3