Sử dụng bộ hóa chất SuperMixPCR Kit để tổ hợp thành phần PCR tiêu chuẩn cho tất cả các cặp mồi PCR. Dung l−ợng hỗn hợp PCR cho mỗi mẫu là
42 μl. PCR đ−ợc tiến hành trên máy chu trình nhiệt (iCycler BioRad, Mỹ) (hình PL 6.8 A, phụ lục 6), sử dụng ống PCR thành mỏng dung tích 0,2 ml.
- Hóa chất tổng hợp cho phản ứng PCR với mồi COI Mỗi 45 μl hỗn hợp cho phản ứng PCR chứa:
SuperMix PCR kit: 42 μ Mồi xuôi: 1,25 μl Mồi ng−ợc: 1,25 μl
Template DNA: 1,5 μl ADN tách triết từ ong
- Chu kỳ nhiệt của PCR với cặp mồi COI gồm hai giai đoạn kế tiếp nhau. Giai đoạn đầu gồm b−ớc biến tính ở 950C - 3’ và 35 chu kỳ: 950C - 45’’, 450C - 45”, 720C - 1'30'', tiếp theo là 720C - 3’ cho tới 40C.
- Hóa chất tổng hợp cho phản ứng PCR với mồi Noncoding Mỗi 50 μl hỗn hợp cho phản ứng PCR chứa:
PCR buffer: 5 μl 10 X PCR buffer
(10 X PCR buffer = 500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, 1% Triton X, pH 9) Primers: 0,25 μl
dNTPs: 0,25 μl dNTPs
(mỗi 20mM chứa dATP, dTTP, dCTP, dGTP) MgCl2: 8 μl 25 mM MgCl2
Template ADN: 0,5-1 μl DNA tách triết từ ong Taq polymerase: 0,25 ul
N−ớc tinh kiết: 35,5 μl, đựng trong ống 50 μl
- Chu kỳ nhiệt của PCR với cặp mồi Noncoding cũng gồm hai giai đoạn kế tiếp nhau. Giai đoạn đầu gồm b−ớc biến tính ở nhiệt độ là 940C kéo dài 3'; chu kỳ 2 (35 vòng với 3 b−ớc nhiệt): tại 940C kéo dài 20'', 400C duy trì 1'30'', 720C với thời gian là 2'; chu kỳ 3 là 720C kéo dài 1'.
Hình 2.19. Chu trình PCR để nhân bản ADN đích đ−ợc cài đặt vào máy