Sử dụng thư viện cDNA có hai ưu điểm sau:
- Các dòng cDNA chứa trình tự mã hóa liên tục của một gen. Nhiều gen ở eukaryote là gián đoạn, có chứa nhiều đoạn intron. Sau khi cắt tiền thân mRNA (pre-mRNA) và nối lại, các đoạn intron đã bị loại và mRNA hoàn thiện (mature mRNA) có trình tự mã hóa liên tục được tạo thành. Do cDNA được phiên
mã ngược từ khuôn mẫu mRNA hoàn thiện nên các dòng cDNA có thể tổng hợp protein cần thiết với số lượng lớn như mong muốn.
- Nhiều protein được tổng hợp với số lượng lớn bởi những tế bào chuyên hóa và như vậy trong các tế bào này mRNA của protein đó sẽ có tỷ lệ cao và thư viện cDNA được tạo ra từ các tế bào này sẽ có nhiều cDNA mã hóa cho các protein tương ứng. Sự dồi dào cDNA của một vài loại mRNA nào đó làm giảm nhẹđáng kể việc xác định đúng dòng mong muốn từ thư viện gen.
Phương pháp tổng hợp gen từ mRNA ngày càng được phát triển, nó kết hợp với các phương pháp khác của sinh học phân tử cho phép ứng dụng trong nhiều lĩnh vực.
Các bước chính của quá trình xây dựng thư viện cDNA như sau:
1. Chọn lọc kích thước của cDNA
cDNA sau khi cắt hạn chếđược phân đoạn bằng sắc ký cột Sepharose để loại bỏ những linker thừa và các phân tử cDNA có kích thước nhỏ hơn 500 bp. Cột sắc ký thường có kích thước 27´0,3 cm thích hợp cho việc phân đoạn các cDNA.
2. Gắn các cDNA với các nhánh của bacteriophage l
Thông thường cần phải tiến hành thử một loạt các phản ứng gắn và phản ứng đóng gói. Trong các phản ứng này, một lượng không đổi của các nhánh bacteriophage lđược gắn với các lượng khác nhau của cDNA, mục đích là để xác định lượng cDNA tạo ra ít nhất là 5´ 106 bacteriophage tái tổ hợp.
Phản ứng gắn cần được thiết kế sao cho tối thiểu một bacteriophage tái tổ hợp đơn sẽ chứa nhiều hơn một phân tử cDNA bằng cách dùng tỷ lệ của các nhánh được phosphoryl hóa và cDNA để chỉ 5% bacteriophage được tái tổ hợp. Nếu sử dụng các nhánh dephosphoryl hóa, thì các bacteriophage không tái tổ hợp bịức chế hiệu quả, và vì thế không thể xác định lượng cDNA cần thiết để tạo ra một quần thể bacteriophage chứa 5% thể tái tổ hợp.
Việc sử dụng các nhánh dephosphoryl hóa hoặc các nhánh có đầu tận cùng không tương thích, tạo ra bằng cách lấp đầy từng phần, được khuyến cáo sử dụng khi xây dựng thư viện cDNA trong các bacteriophage như lgt11, lgt18-23 và lZAP, là những vector không có hệ thống cho phép chọn lọc dựa theo các bacteriophage bố mẹ. Số lượng các thể không tái tổ hợp có thểđược giảm xuống khoảng 100 lần bằng cách dùng các nhánh dephosphoryl hóa. Trong hệ thống này, các bacteriophage không tái tổ hợp tạo thành các plaque màu xanh trên các chủng E. coli thích hợp khi có mặt của IPTG và X-gal, trong khi đó các plaque tái tổ hợp là không màu.
3. Phân tích các đoạn chèn cDNA
Thu thập khoảng mười hai plaque của bacteriophage tái tổ hợp và chuẩn bị DNA để cắt bằng RE thích hợp. Phân tích kích thước của các đoạn chèn cDNA bằng điện di trên agarose gel 1%, dùng DNA marker có các đoạn từ 500 bp tới 5 kb. Nếu các bacteriophage tái tổ hợp chứa các đoạn chèn có kích thước khác nhau và nếu kích thước trung bình của chúng xấp xỉ 1 kb hoặc lớn hơn, thì có thể tiến hành các bước tiếp theo (ví dụ: tạo ra thư viện cDNA hoàn chỉnh). Nếu kích thước trung bình của các đoạn chèn nhỏ hơn 1 kb một cách rõ rệt, thì chất lượng của thư viện là không cao. Trong trường hợp này cần quay lại phân tích chất lượng của mRNA khởi đầu và các phản ứng tổng hợp cDNA.
4. Tạo thư viện cDNA hoàn chỉnh
Nếu sử dụng các nhánh dephosphoryl hóa để xây dựng thư viện cDNA, thì tính toán lượng cDNA cho kết quả tăng gấp 10 lần số lượng của các plaque không tái tổ hợp. Nếu sử dụng các nhánh phosphoryl
hóa, thì tính toán lượng cDNA cho kết quả quần thể bacteriophage chứa xấp xỉ 5% các thể tái tổ hợp. Thiết kế một phản ứng gắn quy mô lớn, tăng số lượng của tất cả các thành phần ở một tỷ lệ thích hợp. Chắc chắn rằng thiết kế phản ứng gắn đối chứng chỉ chứa các nhánh của bacteriophage lmà không chứa cDNA. Đóng gói tất cả các hỗn hợp gắn bằng cách thiết kế một chuỗi các phản ứng gắn, mỗi phản ứng chứa 0,5 mg các nhánh của bacteriophage l. Gộp các tiểu thể đóng gói và xác định độ chuẩn của bacteriophage gốc trên các chủng vi khuẩn thích hợp.
5. Khuếch đại thư viện cDNA
- Vector lgt10. Để thiết lập một sự cung cấp lâu dài của thư viện, thì nó cần phải được khuếch đại bằng sự sinh trưởng trên chủng E. coli thích hợp (chẳng hạn chủng BNN102) trên đĩa agar. Nếu thư viện chỉ được sàng lọc một lần, bước khuếch đại này có thể bỏ qua và các bacteriophage có thể được dàn mỏng trực tiếp trên chủng BNN102 ở một mật độ tối ưu để tiến hành sàng lọc.
- Vector lgt11 và các dẫn xuất của nó và lZAP, lZAPII. Các thư viện cDNA được xây dựng trong các vector biểu hiện lgt11, lgt18, lgt20 và lgt22 phải được khuếch đại trên chủng E. coli Y1090hsdR (hoặc nếu là vector lZAP thì trên chủng BB4, vector lZAPII thì trên chủng XL1-Blue). Các chủng này là không hoàn hảo cho sự cắt hạn chế kiểm soát vật chủ nhưng lại mang một hệ thống methyl hóa hoạt động. Các vị trí tiềm tàng cho phản ứng cắt hạn chế bằng hệ thống EcoK sẽ được methyl hóa trong suốt quá trình khuếch đại sao cho, nếu cần thiết, các thể tái tổ hợp có thể được dùng để gây nhiễm chủng E. coli khả biến-cắt hạn chế. Trong suốt quá trình khuếch đại, điều quan trọng là ức chế sản xuất các protein độc tố tiềm tàng bới các bacteriophage tái tổ hợp.
Tài liệu tham khảo/đọc thêm
1. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K. 2002. ShortProtocol in Molecular Biology. Vol 1 and 2. 5th ed. John Wiley & Sons, Inc. USA. Protocol in Molecular Biology. Vol 1 and 2. 5th ed. John Wiley & Sons, Inc. USA.
2. Brown TA. 2001. Gene Cloning-An Introduction. 4th ed. Blackwell Science, Oxford, UK.
3. Calladine CR and Drew HR. 1997. Understanding DNA: The Molecule and How It Works. 2nd ed.
Academic Press, London, UK.
4. Glick BR and Pasternak JJ. 2003. Molecular Biotechnology: Principles and Applications ofRecombinant DNA. 3rd ed. ASM Press, USA. Recombinant DNA. 3rd ed. ASM Press, USA.
5. Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J. 1989. Molecular Cloning-A Laboratory Manual. Cold SpringHabor Laboratory Press, USA. Habor Laboratory Press, USA.
6. Ohman DE. 1989. Experiments in Gene Manipulation. Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey,USA. USA.
7. Primrose SB, Twyman R and Old RW. 2001. Principles of Gene Manipulation. 6th ed. BlackwellScience, Oxford, UK. Science, Oxford, UK.
8. Rapley R and Walker JM. 1998. Molecular Biomethods Handbook. Humana Press Inc. New Jersey,USA. USA.
9. Surzycki S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, Germany.
1Vòng cặp tóc: hình dạng của phân tử DNA hoặc RNA được dùng làm mồi cho quá trình tổng hợp sợi thứ hai.2cI repressor: gen ức chế có sản phẩm protein liên kết với vùng operator hoặc promoter của gen và kìm hãm phiên 2cI repressor: gen ức chế có sản phẩm protein liên kết với vùng operator hoặc promoter của gen và kìm hãm phiên mã bằng cách ngăn chặn sự liên kết của RNA polymerase.
Chương 7
Biểu hiện gen tái tổ hợp trong
Escherichia coli
Vector biểu hiện là vector có thể mang các gen ngoại lai mong muốn cho phép thực hiện sự phiên mã của các bản sao được tạo dòng và sự dịch mã các mRNA của chúng trong Escherichia coli. Những vector như thế được dùng để biểu hiện các gen của eukaryote trong E. coli hoặc tăng hiệu suất các sản phẩm của gen ở prokaryote. Mặc dù E. coli không phải là một vật chủ lý tưởng để biểu hiện các gen của eukaryote do chúng không có khả năng sửa đổi hậu dịch mã (post-translation modification) cho các chuỗi polypeptide của các protein có cấu trúc phức tạp. Tuy nhiên, trong một số trường hợp người ta vẫn có thể
sử dụng vi khuẩn E. coli cho những protein có cấu trúc đơn giản hơn. Đối với những protein có cấu trúc phức tạp, vật chủ thường được sử dụng là các cơ thể eukaryote (ví dụ: nấm men Saccharomyces cerevisiae, nấm mốc Aspergillus niger…) do chúng có thể hậu dịch mã được.
Để biểu hiện tất cả các gen ngoại lai trong E. coli phải bắt đầu bằng việc gắn đoạn gen ngoại lai vào trong vector biểu hiện (thường là plasmid). Vector này phải có đủ các cấu trúc cần thiết sau:
- Trình tự khởi đầu sao chép (ori)để có thể tạo ra nhiều bản sao trong tế bào vật chủ.
- Các trình tự mã hóa gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker) để đảm bảo duy trì vector trong tế
bào.
- Một promoter kiểm soát phiên mã (ví dụ: lac, trp hoặc tac) cho phép sản xuất một lượng lớn mRNA từ các gen được tạo dòng.
- Các trình tự kiểm soát dịch mã như trình tự liên kết ribosome được bố trí thích hợp và codon khởi
đầu AUG.
- Một polylinker đểđưa gen ngoại lai vào trong một hướng chính xác với promoter.
Chỉ khi được cấu trúc đầy đủ như thế, các vector biểu hiện mang gen ngoại lai mới được biến nạp vào chủng E. coli thích hợp.
Chương này mô tả các phương pháp và các plasmid vector được sử dụng để sản xuất các protein dung hợp (fusion protein) và các protein nguyên thể (native protein) trong vi khuẩn. Các protein dung hợp có thể được sản xuất với một lượng lớn, dễ dàng tinh sạch và có thể được dùng để gây ra một đáp ứng miễn dịch. Các protein nguyên thể có thểđược sản xuất trong vi khuẩn bằng cách gắn một promoter mạnh và một trình tự liên kết ribosome hiệu quả ngược hướng với gen được tạo dòng (vùng 5’ không dịch mã). Thông thường, các protein được biểu hiện ở mức độ cao trong các thể vùi không hòa tan.