(%G + C) là nồng độ phần trăm của guanine và cytosine
(%f) là phần trăm của formamide
n là chiều dài của thể lai (theo base).
Cường lực dùng trong các thí nghiệm lai là số nghịch đảo của giá trị chuẩn C (criterion value) được đưa ra bởi biểu thức 3:
Trong đó
DNA đích có độ tương đồng giống y hệt hoặc gần giống với mẫu dò có thể được xác định dưới các điều kiện cường lực cao (ví dụ: 5oC<C <10oC), các điều kiện cường lực thấp thích hợp cho các chuỗi ít tương đồng.
Thông thường, phản ứng lai và các bước rửa đầu tiên được tiến hành ởđiều kiện cường lực thấp (ví dụ: Tm = 30oC) và cường lực được tăng lên dần trong các bước rửa tiếp theo.
Biểu thức 1 và 2 chỉ chính xác trong trường hợp các DNA sợi đôi dài hơn 100-200 nucleotide. Các mẫu dò oligonucleotide được dùng thường xuyên để sàng lọc các thư viện cDNA hoặc genomic DNA và phân tích Northern, và đôi khi chúng cũng được dùng trong các thí nghiệm lai Southern. Các phân tử lai ngắn có độổn định thấp (ngay cả khi độ tương đồng 100%), đặc biệt trong suốt các bước rửa, bởi vì nồng độ mẫu dò trong đệm rửa hầu như là bằng không. Như vậy, các bước rửa cần tiến hành trong thời gian ngắn (2-5 phút).
Hơn nữa, độổn định của các sợi đôi oligonucleotide bịảnh hưởng lớn bởi thành phần nucleotide và bởi hiện tượng ghép đôi không tương xứng. Tm của các mẫu dò oligonucleotide ngắn hơn 50 nucleotide thường được tính bằng biểu thức 4:
Tm (oC) = 4 (G + C) + 2(A + T) (4)
Trong đó
A, C, G và T là số các nucleotide tương ứng. Tuy nhiên, thông thường các điều kiện thí nghiệm của phản ứng lai đích thực với các mẫu dò oligonucleotide (đặc biệt khi phân tích các genome lớn) phải được xác định trên cơ sở kinh nghiệm.
Các thí nghiệm lai trên màng thường được tiến hành bằng cách đánh dấu mẫu dò bằng 32P (mặc dù các đồng vị phóng xạ khác như 35S cũng có thể được sử dụng). Phản ứng lai của Southern đòi hỏi hoạt tính đặc hiệu của mẫu dò tối thiểu phải là 109 dpm/ μ g, mặc dù hoạt tính 108 dpm/ μ g có thể được xem như là chấp nhận được trong các ứng dụng cần cường lực thấp. Các phương pháp không dùng đồng vị phóng xạ (ví dụ: digoxigenin-dUTP) ngày càng được sử dụng phổ biến hơn mặc dù độ nhạy của chúng là không thể so với các phương thức dùng đồng vị phóng xạ (Hình 5.6). Nhưng các kỹ thuật không dùng đồng vị phóng xạ an toàn hơn cho nghiên cứu viên, tạo ra các mẫu dò có thể được bảo quản trong thời gian dài trước khi dùng và kết quả phát hiện các tín hiệu lai nhanh hơn.
Hình 5.6. Hình ảnh phân tích Southern blot của hai thí nghiệm khác nhau. (A) Hình ảnh phóng xạ tự ghi trên phim X-quang với mẫu dò được đánh dấu 32P. (B) Hình ảnh bắt màu trên màng lai Hybond-N với mẫu dò được đánh dấu digoxigenin-dUTP. Các băng màu đen là tín hiệu lai giữa DNA đích và mẫu dò.