Phage l là một virus mang DNA sợi đôi có kích thước khoảng 50 kb, DNA của nó ở dạng phân tử
mạch thẳng có hai đầu bổ trợ sợi đơn dài 12 nucleotide (được dùng làm đầu cos). Sau khi xâm nhiễm vào vi khuẩn vật chủ, DNA tạo vòng ngay lập tức bằng cách ghép hai đầu kết dính cos nhờ enzyme DNA ligase của vật chủ (Hình 4.8). Các giai đoạn tiếp đó có thể dẫn đến việc hoặc làm tan (lysis) tế bào vật chủ
(bao gồm việc sản xuất và giải phóng các phage thế hệ con) hoặc là gây ra hiện tượng tiềm tan (lysogeny) (trong giai đoạn này λ DNA hợp nhất vào trong chromosome của vật chủ).
Các phage có khả năng thực hiện tải nạp mang gen từ tế bào vi khuẩn cho (donor) sang tế bào nhận (recipient). Vector phage λ được sử dụng rộng rãi để xây dựng thư viện gen (gene library), vì nó mang
được đoạn DNA ngoại lai lớn hơn (15-23 kb) so với plasmid, dễ bảo quản, dễ tách ra để phân tích. Ưu
điểm nổi bật của các phage λ là chúng có hệ thống tựđộng xâm nhập và sinh sản trong tế bào vi khuẩn với một hiệu quả cao hơn nhiều so với việc đưa plasmid vào tế bào vi khuẩn bằng biến nạp. Tuy nhiên các
thao tác ban đầu có phức tạp hơn.
Hình 4.8. Bản đồ đơn giản của bacteriophage λ genome. Các gen liên quan đến các chức năng khác nhau đã được trình bày trên sơđồ. cIII, N, cI, cro và cII: các gen liên quan đến hoạt động điều hòa, miễn dịch tiền phage, siêu nhiễm. O và P: các gen tổng hợp DNA. Q: gen điều hòa chức năng muộn. S và
R: các gen phân giải tế bào vật chủ. PL: promoter bên trái, PR: promoter bên phải, L-cos: đầu kết dính bên trái, R-cos: đầu kết dính bên phải.
1. Đặc điểm của bacteriophage λ
Trước đây, người ta nghĩ rằng việc sử dụng phage λ làm vector là rất bất tiện do DNA của nó quá dài (50 kb), muốn cắt ra nhiều đoạn thì phải có nhiều trình tự cắt. Tuy nhiên, về sau người ta đã phát hiện
ở giữa DNA của phage λ có vùng đệm (stuffer) hay còn gọi là vùng trung tâm có chiều dài bằng khoảng 1/3 chiều dài của phage λ , vùng này không quan trọng và nếu cắt nó đi thì vẫn không ảnh hưởng đến khả
năng sinh sản của phage l trong tế bào vi khuẩn chủ và khả năng làm tan tế bào chủ. Vì thế, người ta đã cắt bỏđoạn stuffer để lắp các đoạn gen ngoại lai vào. Do DNA phage λ có dạng mạch thẳng nên khi bị cắt
ở giữa sẽ tách rời làm thành hai nhánh (arms): phải và trái. Đoạn gen ngoại lai được gắn vào giữa sao cho DNA tái tổ hợp không lớn hơn 105% hay nhỏ hơn 78% của bộ gen bình thường của phage λ . Khả năng có thể mang một DNA ngoại lai dài hơn của plasmid là một ưu thế của phage λ . Điều đó có nghĩa rằng khi lấy đoạn stuffer ra (chỉ còn 60% chiều dài bình thường của phage λ ) thì nó quá ngắn để lắp vào đầu, nó chỉ lắp được khi DNA ngoại lai gắn thêm vào chỗ trống. Nhờ vậy, dễ xác định DNA ngoại lai đã gắn vào phage λ hay chưa và đồng thời tính chất này cũng giúp loại bỏ các phage λ khi đoạn DNA ngoại lai bị cắt rời ra.
Trên vector phage λ người ta cũng đã chọn được các vị trí nhận biết cho các enzyme cắt hạn chế, và xây dựng phương pháp đóng gói in vitro (in vitro packing) để đưa đoạn DNA đã được gắn vào đầu của phage.
2. Tạo dòng trong bacteriophage λ
Bacteriophage λ với genome phức tạp và lớn được dùng như một vector, DNA của nó chứa một số
vị trí thích hợp cho các RE cần thiết để tạo dòng. Các bước tạo dòng trong phage λđược tóm tắt như sau (Hình 4.9 và 4.10):
- Tinh sạch DNA vector bằng ly tâm theo gradient tốc độ hoặc điện di gel sau khi đã được cắt bằng RE.
- Các nhánh phải và trái sau đó được liên kết với DNA ngoại lai kích thước khoảng 20 kb có đầu kết thúc tương đồng với đầu của các nhánh.
- Kết quả các DNA tái tổ hợp được đóng gói in vitro trong các phage λ .
- Các phage tái tổ hợp mang các đoạn DNA ngoại lai mong muốn được xác định bằng phương pháp lai nucleic acid.
- Tinh sạch và chọn tế bào vật chủ (E. coli) cho nó sinh sản để duy trì và phân tích các đoạn DNA ngoại lai.
2.1. Chọn vector λ thích hợp
Có hai yếu tố ảnh hưởng đến sự chọn lọc, đó là enzyme cắt hạn chế được sử dụng và kích thước DNA ngoại lai. Chỉ khoảng 60% genome (nhánh trái và nhánh phải) là cần thiết cho sự sinh tan của phage. Khả năng sống sót của phage giảm khi DNA dài hơn 105% hoặc ngắn hơn 78% so với genome tự nhiên đã
được đóng gói. Điều quan trọng là chọn vector và DNA ngoại lai như thế nào để kích thước của phage tái tổ hợp nằm trong giới hạn cho phép.
Hình 4.9. Các bước tạo dòng trong bacteriophage λ. DNA nguồn được cắt bằng BamHI và được phân đoạn theo kích thước (khoảng 20 kb). Bacteriophage l cũng được phân cắt bằng BamHI. Hai mẫu này được trộn vào nhau và xử lý bằng T4 DNA ligase. Phản ứng gắn xảy ra tạo một bacteriophage λ mới (tái tổ hợp): đoạn stuffer được thay bằng đoạn DNA ngoại lai. Những phân tử này đóng gói in vitro trong
Hình 4. 10 . Phân tử DNA của phage λ . A: Tự tái bản DNA từ dạng vòng của λ làm cho nó trở
thành dạng dây thẳng, hình thành các đoạn chồng lấp lên nhau, với độ dài khoảng 50 kb. B: Mỗi đầu đều chứa đầy 50 kb đơn vị của l DNA , trước khi đuôi được tổng hợp gắn vào sau.
Một số vector λđã được thiết kế thuận lợi cho sinh trưởng của chúng trong E. coli mang prophage P2, phenotype này được gọi là Spi+. Các chủng λ thiếu hai gen cần thiết trong tái tổ hợp (red và gam) biểu hiện phenotype Spi - sẽ sinh trưởng tốt trong các thể tiềm tan P2 chừng nào mà chúng còn mang chuỗi chi (chi là cơ chất cho sự tái tổ hợp được xúc tác bởi hệ thống recA).
Tạo dòng ở các vector λ L47.1, λ 1059 hoặc λ BF101 đã được tiến hành bằng cách loại bỏ đoạn stuffer chứa red và gam. Kết quả thu được phage tái tổ hợp là Spi - và chúng có thểđược nhận biết hoặc chọn lọc bằng khả năng sinh trưởng của chúng trên các thể tiềm tan P2 recA+ của E. coli .
Hầu hết các vector thay thế mất gen gam khi đoạn stuffer bị loại bỏ. Các thể tái tổ hợp được tạo thành với các vector như thế phải được sinh sản trong vi khuẩn recA+. Phage l sep6-lac5 mang các gen
red và gam trong nhánh phải của nó và các thể tái tổ hợp được tạo thành với vector này có phenotype
Spi+ có thểđược nhân lên trong vi khuẩn mang đột biến recA-. 2.2. Những vector λđược cải tiến
Những vector λ thường được cải tiến nhằm mục đích:
- Tăng khả năng thích ứng của các đoạn DNA ngoại lai khác nhau với các RE. - Cho phép chọn lựa phương thức tái tổ hợp mong muốn.
- Cho phép có được các RNA probe sẵn sàng cho việc chuyển mã của DNA ngoại lai gắn vào vector. Điều này giúp chúng ta dễ dàng sàng lọc các thư viện trong quá trình chromosome walking, ví dụ
nhưλ ZAP.
- Phát triển các vector trong quá trình gắn vào cDNA của sinh vật bậc cao, dưới hình thức một polypeptide dung hợp với β-galactosidase. Hình thức này rất hữu ích trong việc chọn lọc kháng thể, ví dụ
Hình 4.11. Vector EMBL3 và EMBL4 được thiết kế từ phage l mang các vị trí nhận biết cho các enzyme SalI, BamHI và EcoRI
Thế hệ gần đây nhất của vector l là EMBL3 và EMBL4 (Hình 4.11), chúng mang các trình tự có tính chất polylinker nằm gần đoạn có thể thay thếđược. Các phage với những thể insert đính bên trong nó có thể được chọn lọc bằng kiểu hình Spi -, chính là chi+. Thể cải tiến từ EMBL3 có những đột biến EMBL3 Sam, EMBL3 Aam Sam. Những đột biến trong vector không chỉ làm gia tăng khả năng chứa của nó, mà còn được sử dụng trong hệ thống chọn lọc những trình tự DNA được phân lập, liên kết với các gen
ức chế (suppressor).