sulphate, sarcocyl) ở nồng độ cao, các dung dịch muối mạnh (guanidinium thiocyanate-GTC) để hòa tan RNA và kết tủa các protein bị biến tính ở cùng một thời gian, và một chất khử (b-mercaptoethanol). Hai loại chất sau có tác dụng ức chế các RNase nội bào và tách các protein liên kết khỏi phân tử RNA. Bên cạnh đó, có thể bổ sung các protease (chẳng hạn protease K) để gây biến tính các thành phần protein của phức chất RNA-protein. Các protein được loại bỏ khỏi mẫu bằng cách chiết (ly tâm) với phenol, phenol:chloroform và chloroform. RNA hòa tan trong pha nước được kết tủa bằng ethanol (hoặc isopropanol) và được thu nhận lại qua ly tâm. RNA được bảo quản trên một năm ở -70oC trong nước có chứa RNasin (nhân tốức chế RNase).
1.2. Phân lập RNA poly(A)+
RNA tổng số của tế bào chứa khoảng 90-99% rRNA và tRNA, trong đó rRNA chiếm khoảng 80-85% và tRNA chiếm khoảng 15-20%. Các RNA này có kích thước và trình tự xác định và có thểđược tách riêng dễ dàng bằng điện di hoặc ly tâm. Riêng mRNA chỉ chiếm khoảng 1-5% RNA tổng số của tế bào, lại có kích thước và trình tự rất đa dạng. Tuy nhiên, chúng có một điểm chung là cấu trúc đuôi polyA (có thể lên tới 100A). Dựa vào cấu trúc này và đặc tính liên kết bổ sung A-T của nucleic acid, có thể tách mRNA ra khỏi mẫu bằng sắc ký ái lực trên cột oligo(dT)-cellulose. Các mRNA sẽ bám lên cột thông qua liên kết bổ sung với oligo(dT) và được thu nhận lại qua ly tâm. Kỹ thuật này cho phép thu nhận mRNA từ những mẫu có khối lượng rất nhỏ.
Hình 6.1. Sơđồ quy trình tinh sạch mRNA từ RNA tổng số
2. Phân tích RNA
2.1. Lai Northern (Northern hybridization)
Phân tích RNA là công việc quan trọng của nhiều nghiên cứu về sinh học phân tử, vì nó có thể cung cấp thông tin về sự biểu hiện của gen trong cơ thể sống. Lai bằng màng lọc (nylon hoặc nitrocellulose) các RNA được phân đoạn với đoạn mồi là nucleic acid đánh dấu đồng vị phóng xạ 32P (hoặc digoxigenin-dUTP) được gọi là phương pháp thẩm tích Northern (Northern blot). Phương thức này bắt nguồn từ phân tích Southern blot (xem chương 5), dựa trên cơ sở khả năng bổ sung của các nucleic acid sợi đơn để tạo thành các phân tử lai. Một cách tóm tắt, RNA được phân chia theo kích thước trên agarose gel dưới các điều kiện biến tính, thẩm tích và liên kết không thuận nghịch với màng nylon hoặc nitrocellulose, lai với đoạn mồi nucleic acid được đánh dấu 32P. Sau khi rửa trôi đoạn mồi không liên kết hoặc liên kết không đặc hiệu, các phân tử RNA lai được phát hiện như là các băng phóng xạ tự ghi trên phim X-quang (Hình 6.2).
Hình 6.2. Phân tích sự biểu hiện của gen bằng lai Northern. Hình phía dưới là điện di RNA tổng số trên agarose gel được biến tính bằng formamide. Hình phía trên là tín hiệu phóng xạ thu được từ phản ứng lai giữa RNA tổng số với mẫu dò được đánh dấu bằng 32P.
Thẩm tích Northern là phương pháp quan trọng để nghiên cứu biểu hiện của gen, do các RNA hiện diện trong tế bào hoặc loại mô quy định mô tả khái quát một phần của genome được biểu hiện trong tế bào hoặc mô đó. Phân tích Northern cho thấy mức độổn định của sự tích lũy chuỗi RNA qui định (thường là mRNA) trong mẫu nghiên cứu. Vì thế, phân tích Northern cho phép người ta liên kết các mức độ biểu hiện mRNA với các tính chất hình thái và sinh lý của cơ thể sống. Kỹ thuật lai Northern là một phương pháp được ứng dụng rộng rãi cho việc phân tích biểu hiện gen. Ví dụ: kỹ thuật này đã được sử dụng cho việc mô tả đặc điểm của các cDNA và gen được tạo dòng, nghiên cứu đặc trưng cơ quan/mô của sự biểu hiện gen, phân tích hoạt tính của các gen nội và ngoại sinh trong cơ thể chuyển gen, và nghiên cứu sự biểu hiện của gen trong mối liên quan với sự phát triển và các yếu tố vô sinh và hữu sinh.
2.2. Lai Dot (Dot hybridization)
Lai dot được Kafatos và cs. (1979) thực hiện đầu tiên bằng cách chấm các mẫu nhỏ của dung dịch RNA lên màng nitrocellulose, sau đó màng được làm khô, lai với mẫu dò đặc trưng RNA hoặc DNA có đánh dấu 32P, và ủ với phim X-quang. Mặc dù khó định lượng chính xác do kích thước của các chấm lớn và khác nhau, nhưng trong nhiều trường hợp có thể thu được một ý tưởng tốt về cường độ biểu hiện của một gen đặc biệt nào đó trong các mô đặc trưng hoặc các tế bào nuôi cấy (Hình 6.3).
Hình 6.3. Phân tích dot đểđịnh lượng RNA. Hàng phía dưới là các nồng độ RNA chuẩn đã biết. Hàng trên là các nồng độ RNA khác nhau được tách chiết từ mô/cơ quan.