cùng một enzyme.
1. Đuôi đồng trùng hợp
1.1. Đuôi dA:dT
Enzyme terminal transferase xúc tác cho sự bổ sung của các deoxyrinucleotide triphosphate (dNTP) vào đầu 3’-OH của DNA sợi đôi hoặc sợi đơn, được dùng để đưa DNA tái tổ hợp vào trong E. coli bằng cách nối dA:dT. Thông thường từ 50-150 gốc dA được bổ sung vào vector DNA và một số tương ứng của các gốc dT vào cDNA sợi đôi, cDNA sợi đôi được đưa vào trong các plasmid vector qua phương thức nối dA:dT. Tuy nhiên, đuôi đồng trùng hợp dA:dT ít khi được dùng để tạo dòng cDNA, lý do chính là không có phương thức thích hợp để cắt cDNA gắn trong plasmid nhờđuôi dA:dT.
1.2. Đuôi dC:dG
Phương pháp được sử dụng rộng rãi hơn để tạo dòng các cDNA bằng đuôi đồng trùng hợp đòi hỏi bổ sung các đuôi dC cho cDNA sợi đôi và các đuôi dG được bổ sung vào plasmid vector đã được cắt hạn chế bằng PstI. Enzyme PstI cắt chuỗi 5’…CTGCAG…3’ tạo ra đầu 3’ tận cùng là cơ chất lý tưởng cho việc bổ sung các đuôi đồng trùng hợp. Các dòng cDNA mang các đuôi dC:dG có thể dễ dàng tách ra khỏi plasmid bằng cách thủy phân nhờPstI (Hình 6.5).
Số lượng các gốc dA:dT và dC:dG cần thiết để cho hiệu suất gắn tối thích cDNA vào plasmid vector đã được xác định, số lượng các gốc trên plasmid và cDNA phải xấp xỉ nhau, với khoảng 100 gốc được bổ sung tới mỗi DNA để nối dA:dT và khoảng 20 gốc để nối dC:dG.
2. Các linker và adapter nhân tạo
Các linker chứa một hoặc nhiều vị trí cắt hạn chế cho phép nối cDNA sợi đôi với các plasmid vector hoặc bacteriophage l vector. cDNA sợi đôi được xử lý với DNA polymerase của bacteriophage T4 hoặc DNA polymerase I của E. coli, các enzyme này loại bỏ đầu tận cùng 3’ sợi đơn so le bằng hoạt tính exonuclease 3’® 5’ và lấp đầy các đầu tận cùng 3’-OH bị khuyết bằng hoạt tính trùng hợp (polymerization). Sự phối hợp của các hoạt tính này đã tạo ra các phân tử DNA đầu bằng, sau đó các cDNA này được ủ với một số lượng lớn các phân tử linker với sự có mặt của bacteriophage T4 DNA ligase (enzyme xúc tác cho quá trình gắn của các phân tử DNA đầu lồi với linker) (Hình 6.6).
Hình 6.5. Tạo dòng cDNA sợi đôi bằng đuôi đồng trùng hợp dG:dC. Enzyme terminal transferase có hoạt tính tạo nhóm homopolymer ở đầu 3’-OH của DNA sợi đôi làm lồi ra một đầu ở cuối cơ chất của nó là DNA sợi đơn.
Hình 6.6. Minh họa một linker. (a) Đoạn 5’-CCGGATCCGG-3’ mang vị trí nhận biết cho BamHI. (b) Linker này được gắn vào cDNA đầu bằng nhờ DNA ligase. (c) Cấu trúc này sau đó được cắt bằng BamHI để tạo ra
đầu 5’ lồi.
Các phân tử DNA sợi đôi mang các đầu kết dính nhân tạo được cắt ở vị trí cắt hạn chế trong linker, tinh sạch, và sau đó gắn với vector cũng được cắt bằng RE tương ứng tạo ra các đầu dính tương đồng với các đầu của linker. Có thể hạn chế sự tái tạo lại vòng của plasmid vector (không tái tổ hợp) bằng cách xử lý các vector được cắt bằng enzyme phosphatase (calf intestinal alkaline phosphatase-CIAP) trước khi thực hiện phản ứng gắn với cDNA.
Việc sử dụng adapter có hiệu quả hơn linker. Các adapter có kích thước ngắn, là các oligonucleotide sợi đôi mang một đầu bằng (để gắn với cDNA sợi đôi) và một đầu tận cùng kết dính (để gắn với đầu tận cùng tương ứng trong vector). Không giống như linker, các adapter không đòi hỏi phải cắt bằng các RE sau khi chúng được gắn với cDNA sợi đôi. Tuy nhiên, các phân tử cDNA mang các adapter được phosphoryl hóa (phosphorylation) có thể tạo thành các phân tử mạch vòng đóng bằng liên kết cộng hóa trị (dạng không thể tạo dòng) hoặc các phân tử mạch thẳng dạng khảm (dạng hoàn toàn không mong muốn) trong suốt phản ứng gắn tuần tự với sự có mặt của vector DNA đã được dephosphoryl hóa (Hình 6.7).
Hình 6.7. Minh họa một adapter. (a) Adapter, có đầu tận cùng 5’ tương ứng với enzyme HindIII, được gắn vào cDNA đầu bằng nhờ DNA ligase. (b) Đầu 5’ của adapter có thể được dephosphoryl hóa để ngăn cản sự tự kết nối lại.
Khi nối các linker hoặc adapter với các phân tử cDNA sợi đôi đầu bằng, phản ứng gắn cần được tiến hành trong một dung tích tối thiểu (để duy trì một nồng độ cao của linker/adapter). Nồng độ phân tử của linker/adapter phải lớn hơn nồng độ của đầu tận cùng của cDNA ít nhất là 100 lần. Cuối cùng, trước khi đoạn cDNA được gắn vào vector, các adapter không có phản ứng và các sản phẩm có trọng lượng phân tử thấp (do phản ứng cắt hạn chế tạo ra) cần được loại bỏ bằng sắc ký cột, điện di agarose hoặc polyacrylamide gel.