1. Tạo dòng mRNA-cDNA
Một phương pháp khác để tạo dòng cDNA là biến nạp vào E. coli các thể lai mRNA-cDNA đã được gắn với các plasmid vector. Các vi khuẩn vật chủ loại bỏ mRNA và thay thế nó bằng DNA. Sau khi sợi cDNA đầu tiên được tổng hợp theo cách thông thường, các gốc dA được bổ sung cho thể lai mRNA-cDNA sau đó được ủ với plasmid mang các đuôi dT. Do đầu tận cùng 3’-OH của RNA kém ít nhất 10 lần trong phản ứng tương đồng với DNA nên hầu hết các gốc dA được bổ sung cho thể lai đều phối hợp ởđầu 3’ của DNA. Việc nối các đầu khác của thể lai với vector có khả năng thành công do mối liên kết hydrogen giữa poly(A) tự nhiên ởđầu 3’ của mRNA và plasmid có đuôi dT. Phương pháp này có một số thuận lợi sau:
- Không cần tổng hợp sợi cDNA thứ hai.
Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp này là có hiệu quả kém ít nhất 10 lần so với phương pháp tạo dòng cDNA sợi đôi và vì thế không thích hợp cho việc xây dựng một số lượng lớn các dòng cDNA.
2. Bổ sung tuần tự các linker khác nhau
cDNA sợi đôi, được tổng hợp bằng cơ chế tự mồi (self-priming), được gắn vào một loại linker nhân tạo trước khi vòng cặp tóc trong cDNA bị cắt. Vì thế, các linker chỉđược bổ sung ở một đầu của cDNA sợi đôi (đầu tương ứng với đầu tận cùng 3’ của mRNA). Sau đó cDNA được tinh sạch khỏi các linker thừa, vòng cặp tóc được cắt bằng nuclease S1 và sửa chữa bằng đoạn Klenow của DNA polymerase I của
E. coli trước khi loại linker thứ hai được gắn vào cDNA. Các linker này sẽđược gắn vào cả hai đầu của cDNA. cDNA được gắn linker kép sau đó được xử lý với các RE thích hợp và gắn vào trong vector bằng phương pháp tạo dòng định hướng (Hình 6.8).
Phương pháp này được dùng để gắn cDNA theo hướng chính xác của các promoter cho phép biểu hiện các đoạn chèn (inserted sequences) trong vi khuẩn. Các bacteriophage l vector cho phép tạo dòng định hướng cũng đã được phát triển trong thời gian gần đây.
3. Tạo dòng cDNA bằng các primer-adapter
Ngày nay, việc sản xuất dễ dàng các oligonucleotide primer của các trình tự xác định đã cho phép phát triển các phương pháp tạo dòng sử dụng primer-adapter chứa một vùng của DNA đồng trùng hợp ở đầu tận cùng 3’ và một vị trí cắt hạn chếởđầu tận cùng 5’. Các chuỗi đồng trùng hợp được dùng làm mồi để tổng hợp sợi thứ nhất và sợi thứ hai của cDNA, và các vị trí cắt hạn chế bên cạnh được sử dụng đểđưa các phân tử cDNA sợi đôi cuối cùng vào trong một vector thích hợp. Trong mô hình đơn giản nhất, phương pháp này cho phép các cDNA được tạo dòng với hiệu suất cao (Hình 6.9).
Hình 6.8. Tạo dòng cDNA bằng cách bổ sung tuần tự các linker nhân tạo. Đoạn Klenow tạo đầu bằng cho cDNA sợi đôi và enzyme nuclease S1 cắt vòng cặp tóc. Các linker thứ nhất và thứ hai được gắn tuần tự vào hai đầu của cDNA, sau đó đoạn cDNA này sẽđược cắt cùng enzyme hạn chế với vector tạo dòng có vị trí nhận biết trên hai linker nhân tạo. Cuối cùng, đoạn cDNA có hai đầu tương đồng được gắn với vector và biến nạp vào E. coli.
Hình 6.9. Tổng hợp cDNA sợi đôi bằng phương pháp primer-adapter
Đoạn cDNA được tổng hợp theo phương pháp trên khi gắn vào trong các vector biểu hiện như lgt20 và lgt22 chỉ có 1/6 cơ hội biểu hiện trong vi khuẩn, lý do: chỉ một nửa các phân tử cDNA được đưa vào trong vector theo hướng chính xác đối với promoter lacZ, và chỉ một trong ba phân tửđược gắn ở hướng phải sẽở trong khung đọc chính xác để sản xuất protein hợp nhất.