+ Phát hiện tế bào T/virus gây bệnh ung thư máu + Phát hiện virus viêm gan B
+ Phát hiện virus Dengue gây bệnh sốt xuất huyết + Phát hiện vi khuẩn lao...
1. Sử dụng PCR để tạo nhanh các gen tổng hợp
Sử dụng phương pháp PCR hai giai đoạn (two-step PCR) để tạo nhanh các gen tổng hợp. Phương pháp này được xây dựng trên cơ sở những nucleotide chồng lên nhau (overlapping), do đó có thểđược sử
dụng để tạo ra đoạn DNA tổng hợp thông qua nhiều vòng khuếch đại PCR. Khả năng tạo ra DNA tổng hợp có nhiều ứng dụng tùy thuộc vào thiết kế của chúng ta. Người ta có thể thiết kế một gen tổng hợp có chứa codon được dùng để biểu hiện protein trong cơ thể sinh vật. Phương pháp này được hoàn tất nhờ sự
giải mã ngược chuỗi amino acid của protein mong muốn. Để thay đổi cấu trúc của codon, gen tổng hợp có thểđược thiết kế có những vị trí cắt hạn chế thuận lợi phục vụ cho thí nghiệm tạo dòng về sau.
Nguyên tắc của PCR hai giai đoạn đó là hai phản ứng PCR xảy ra liền nhau, phản ứng thứ nhất của PCR phát sinh ra sợi khuôn mẫu tương ứng với gen tổng hợp và sau đó nó được khuếch đại trong phản
ứng PCR lần thứ hai (Hình 3.10). Trước khi bắt đầu quá trình này, người ta phải thiết kế cấu trúc và xác
định trình tự nucleotide của gen tổng hợp mà mình mong muốn. Sau đó, trình tự các oligonucleotide (primers) theo chiều dài của gen phải được thiết kế và tổng hợp. Thông thường, người ta tổng hợp các oligonucleotide theo số chẵn với chiều dài khoảng 16-30 nucleotide.
2. Tạo dòng cDNA bằng PCR
Kỹ thuật tạo dòng kinh điển cDNA đòi hỏi nhiều công sức về xây dựng thư viện để bảo quản bacteriophage hoặc plasmid, nó cần một khối lượng công việc chọn lọc một số lượng lớn các phage hoặc plasmid có tính chất tái tổ hợp. Có ba hạn chế trong phương pháp này:
- Cần có một lượng cơ chất (ít nhất 1 µg) mRNA tinh sạch làm vật liệu khởi đầu để xây dựng thư
viện với mức độđa dạng đầy đủ cho nghiên cứu.
- Khó khăn thuộc về bản chất bên trong của những phản ứng enzyme tiếp nối nhau làm cho việc tạo dòng cDNA có kết quả thấp, và những dòng gen bịđứt đoạn.
- Việc sàng lọc một thư viện với kỹ thuật lai đòi hỏi nhiều thời gian.
Kỹ thuật PCR hiện nay có thể giúp chúng ta khắc phục những nhược điểm nói trên, làm cho việc tạo dòng cDNA trở nên dễ dàng hơn. Sử dụng hai primer đặc hiệu của gen, một cDNA có trình tự đã được biết rõ, người ta cho khuếch đại trong PCR. Tuy nhiên, cái khó là làm sao phân lập được những bản sao của cDNA hoàn chỉnh (full-length) từ mRNA, trên cơ sở thông tin về trình tự rất hạn chế. Trình tự chưa biết này nằm kề một đoạn nhỏ của trình tự đã biết rõ. Trình tự chưa biết không thể khuếch đại bằng phương pháp PCR thông thường. Do đó, phương pháp PCR mỏ neo và phương pháp PCR đảo ngược đã
được phát triển trong thời gian gần đây để giải quyết vấn đề này.
Hình 3.10. Sơ đồ minh họa một phản ứng tạo nhanh gen tổng hợp thông qua phương pháp PCR hai giai
đoạn. Gen quan tâm được khuếch đại trong phản ứng PCR thứ nhất với cặp oligonucleotide đặc hiệu gen nhưng có đưa vào vùng chồng lên nhau (primer A và primer B). Trong phản ứng PCR thứ hai, các primer mở rộng C và D gắn với vùng chồng lên nhau của sản phẩm PCR lần thứ nhất và bổ sung tất cả các nhân tố điều hòa cần thiết cho sự phiên mã và dịch mã. Sản phẩm PCR lần thứ nhất được pha loãng 200 lần để làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR thứ hai.
2.1. PCR mỏ neo
Kỹ thuật PCR mỏ neo có một điểm chung là: Tạo dòng DNA đi từ một đoạn trình tựđã biết rồi tới
đoạn trình tự kế cận chưa biết nhờ sự giúp đỡ của một primer đặc hiệu đối với gen tại một đầu sợi đơn và một primer tổng hợp tại một đầu sợi đơn khác. Do chỉ có primer đặc hiệu đối với gen mới có thể neo trong PCR làm dễ dàng hơn cho việc thu thập một lượng lớn sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu so với PCR chuẩn. Kỹ thuật này khác với PCR chuẩn là chỉ cần một primer đặc hiệu cho phản ứng. Trong kỹ thuật PCR mỏ neo, một đuôi nhân tạo của các gốc dA được thêm vào đoạn cuối của DNA khuôn mẫu. Sự
khuếch đại DNA xảy ra khi có primer của một trình tự đã biết trước và một primer thứ hai có các gốc oligo(dT).
2.2. PCR đảo ngược
Phương pháp PCR đảo ngược có thuận lợi lớn hơn nhờ khuếch đại trình tự kế cận chưa biết bằng hai primer đặc hiệu của gen. PCR đảo ngược hoạt động theo nguyên tắc tạo dòng sợi đơn một trình tự
DNA. Sau đó, DNA này được cắt bằng RE ở vị trí tương ứng để tạo ra DNA đích, tiếp theo nó hoạt động theo chu trình có tính chất monomer. DNA này được khuếch đại lên bằng các primer tương đồng tại hai
Hình 3.11. Ứng dụng PCR đảo ngược. Hai primer đặc hiệu được gắn vào trình tự đã biết và sau đó DNA được khuếch đại theo chiều mũi tên.
Ban đầu là sợi 5’®3’của mRNA cho vào phản ứng phiên mã ngược thành sợi đơn cDNA 3’®5’, tiếp tục tổng hợp sợi đơn của cDNA lần thứ hai, cho ra sợi đôi cDNA (5’®3’và 3’®5’). Sợi này có chứa một trình tựđã biết rõ. Kỹ thuật tạo dòng làm cho cDNA thẳng biến thành cDNA vòng sợi đôi. Tiếp đến, mở
vòng nhờ RE cắt trình tựđược biết làm đôi, một nửa ởđầu sợi thẳng bên này, một nửa bên kia. Kéo thẳng sợi DNA và khuếch đại trong PCR (Hình 3.11).
3. Ứng dụng trong di truyền
PCR giúp đắc lực cho việc lập bản đồ gen (gene mapping) của sinh vật. Phương pháp này có tên là phân tích DNA đa hình được khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD). Trong phương pháp RAPD, PCR được thực hiện với các primer chọn ngẫu nhiên. Kết quả là tạo ra một số đoạn DNA có chiều dài khác nhau đặc trưng cho mỗi loài, thậm chí mỗi cá thể. So sánh điện di sản phẩm PCR của nhiều giống có đặc điểm khác nhau trong cùng loài, với nhiều primer khác nhau có thể giúp xác định bản đồ gen của sinh vật.
Hiện nay, ngoài RAPD còn có nhiều loại chỉ thị phân tử (molecular marker) khác đã được phát triển nhưđa hình chiều dài các đoạn cắt hạn chế (restriction fragment length polymorphism, RFLP), vi vệ tinh (microsatellite) hay còn gọi là sự lặp lại các đoạn nucleotide đơn giản (simple sequence repeats, SSR), và
đa hình chiều dài đoạn DNA được khuếch đại chọn lọc (amplified fragment length polymorphism, AFLP). Các kỹ thuật này được xây dựng trên cơ sở PCR (ngoại trừ RFLP) có triển vọng rất lớn trong nghiên cứu da dạng di truyền (genetic diversity), định vị gen (gene location) và lập bản đồ gen do chúng đơn giản về
mặt kỹ thuật, tiết kiệm thời gian và có hiệu quả cao. PCR hiện nay còn được dùng thay thế cho điện di isozyme để phân loại thực vật, xác định mối quan hệ của chúng một cách chính xác.
4. Ứng dụng trong chẩn đoán lâm sàng
Trước đây, kỹ thuật phân tích RFLP thường được sử dụng để xác định các đột biến dẫn tới các bệnh di truyền ở người. Tuy nhiên, kỹ thuật này chỉ áp dụng được trong trường hợp đột biến đó dẫn đến sự thay
đổi trình tự có thể phát hiện được trên cơ sởđộ dài của đoạn DNA. Ngược lại, trường hợp một sốđột biến gây ra bệnh di truyền nhưng không tạo ra các đoạn DNA cắt hạn chế khác nhau khi phân tích RFLP thì chỉ có thể phát hiện nếu xác định được trình tự đoạn DNA chứa điểm đột biến. Như vậy, chúng ta buộc phải xây dựng thư viện hệ gen (xem chương 5) cho mỗi người, sau đó tạo dòng và xác định trình tự
nucleotide của dòng gen đột biến, vì thế phương pháp này đòi hỏi tốn nhiều thời gian.
Kỹ thuật PCR cho phép đưa ra một chọn lựa khác đơn giản hơn cho phép thu nhận thông tin về
trình tự gen rất nhanh bằng cách khuếch đại đoạn gen chứa điểm đột biến và sau đó phân tích trực tiếp các sản phẩm PCR thu được. Khả năng nhận dạng nhanh các đột biến không chỉ quan trọng trong chẩn
đoán lâm sàng, mà còn đẩy nhanh việc nghiên cứu các bệnh di truyền.
Độ nhạy cao của kỹ thuật PCR cho phép ứng dụng dễ dàng trong các chẩn đoán bệnh nhiễm trùng. Ví dụ: việc khuếch đại một số lượng lớn DNA virus trong các mẫu bệnh cho khả năng chẩn đoán bệnh sớm hơn trước khi triệu chứng bệnh bắt đầu xuất hiện. Điều này giúp cho thầy thuốc có phác đồ điều trị
bệnh thích hợp, đặc biệt các bệnh ung thư do virus gây ra (ví dụ: ung thư vòm họng do papillomavirus người gây ra) và thông thường có kết quả hơn nếu như bắt đầu điều trịở giai đoạn sớm.
Tài liệu tham khảo/đọc thêm
1. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K. 2002. ShortProtocol in Molecular Biology. Vol 1 and 2. 5th ed. John Wiley & Sons, Inc. USA. Protocol in Molecular Biology. Vol 1 and 2. 5th ed. John Wiley & Sons, Inc. USA.
2. Chen BY and Janes HW. 2002. PCR Cloning Protocols. 2nd ed. Humana Press Inc. New Jersey, USA.
3. Dieffenbach CW and Dveksler GS. 2003. PCR Primer: A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold SpringHabor Laboratory Press, NewYork, USA. Habor Laboratory Press, NewYork, USA.
4. Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ and White TJ. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods andApplications. Academic Press, New York, USA. Applications. Academic Press, New York, USA.
5. Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J. 1989. Molecular Cloning-A Laboratory Manual. Cold SpringHabor Laboratory Press, USA. Habor Laboratory Press, USA.
6. Rapley R and Walker JM. 1998. Molecular Biomethods Handbook. Humana Press Inc. New Jersey,USA. USA.
7. Surzycki S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, Germany.
1RAPD (random amplified polymorphic DNA): DNA đa hình được khuếch đại ngẫu nhiên.
Chương 4
Các hệ thống vector
Có ba nhóm vector chính được sử dụng trong tạo dòng DNA và nhân bản chúng trong tế bào vật chủ (E. coli hoặc nấm men), bao gồm: 1) Nhóm plasmid, 2) Nhóm phage/phagemid, và 3) Nhóm nhiễm sắc thể nhân tạo (artificial chromosome: BAC và YAC). Ý tưởng về vector chuyển gen bắt nguồn từ các plasmid của vi khuẩn. Vector chuyển gen là phân tử DNA có khả năng tự tái sinh, tồn tại độc lập trong tế
bào và mang được các gen cần chuyển. Các vector chuyển gen phải thỏa mãn các yêu cầu tối thiểu sau: - Có trình tự khởi đầu sao chép (ori)để có thể tự sao chép mà tồn tại độc lập.
- Có các vị trí nhận biết đơn (single recognition sites-SRS), nơi mà các enzyme hạn chế nhận biết để
cắt rời làm chỗ lắp ráp đoạn gen ngoại lai vào. Các trình tự này thường nằm xa điểm khởi đầu sao chép để
tránh bị cắt nhầm.
- Có trình tự khởi động (promoter) để tiến hành phiên mã gen ngoại lai.
- Đảm bảo sự di truyền bền vững của DNA tái tổ hợp ở dạng độc lập hay gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào vật chủ.
- Có các gen chỉ thị (marker genes) để dễ dàng phát hiện ra thể tái tổ hợp.
Ngoài ra, chúng còn phải có những đặc tính bổ sung khác để cho việc tạo dòng dễ thực hiện như là: - Chứa các gen làm vô hiệu hóa đoạn DNA không mong muốn được gắn vào.
- Có nhiều bản sao đểđược tách ra khỏi tế bào với số lượng lớn và đảm bảo sự khuếch đại của gen ngoại lai.
- Ngoài promoter cần có thêm các trình tự nucleotide khác cần thiết cho sự biểu hiện của gen, chẳng hạn như: RBS (ribosome binding sites-vùng liên kết với ribosome để dịch mã).
Giá trị của vector ở chỗ nó được thiết kế sao cho thật thuận tiện với các mục đích sử dụng khác nhau. Không có vector toàn năng cho chuyển gen, mà cần có sự chọn lựa tùy mục đích và kích thước của
đoạn gen được tạo dòng. Chúng được thiết kế với nhiều chức năng chuyên biệt để mang được các trình tự
nucleotide như mong muốn. Các vector chuyển gen có năm ứng dụng quan trọng chủ yếu:
- Tạo dòng (cloning) và khuếch đại (amplification) một đoạn trình tự của DNA (nhiều bản sao giống nhau).
- Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn trình tự DNA. - Đưa gen vào các tế bào vi sinh vật hay các động-thực vật . - Sản xuất RNA.
- Sản xuất protein từ gen được tạo dòng.
Chương này giới thiệu sáu loại vector phổ biến (thuộc ba nhóm vector: plasmid, phage/phagemid và nhiễm sắc thể nhân tạo) dùng trong tạo dòng gen (gene cloning): plasmid, bacteriophage λ , cosmid, bacteriophage M13, BAC và YAC.