Để đưa toàn bộ các gen của genome vào một thư viện, trước hết genome phải được cắt bởi enzyme hạn chế thành các đoạn DNA có kích thước thích hợp tùy thuộc vào loại vector nhận chúng. Genomic DNA thường được cắt bằng enzyme hạn chế có trình tự nhận biết 4 bp, ví dụ nhưMboI nhận biết trình tự 5’-GATC-3’ . Tuy nhiên, không phải dễ dàng thu được một gen nguyên vẹn nằm trên một đoạn DNA. Trong thực tế, một gen thường bị cắt thành nhiều đoạn DNA do vị trí nhận biết của enzyme nằm ngay trong gen.
Hình 5.1. Xây dựng thư viện genomic DNA. Các giai đoạn trong xây dựng thư viện DNA trong vector bacteriophage l . a, b, c và d trình bày sự khác nhau (nhưng chồng lên nhau) của các đoạn DNA trong genome, được hợp nhất trong các vector riêng rẽ và đại diện như là các dòng riêng biệt trong một thư viện.
Thông thường, một phản ứng cắt từng phần genomic DNA được tiến hành bằng cách dùng một lượng tối thiểu enzyme và ủ trong một thời gian ngắn sao cho mọi vị trí nhận biết không bị cắt đồng thời . Do các vị trí cắt được phân bố ngẫu nhiên nên một gen vẫn có thểđược bảo toàn nguyên vẹn ngay khi nó chứa vị trí nhận biết trong gen. DNA sau đó được phân đoạn và chỉ có các đoạn có kích thước nằm trong phạm vi mong muốn được chọn lọc. Các đoạn DNA được đưa vào vector thích hợp. Tập hợp các vector chứa các đoạn genomic DNA tạo thành thư viện genomic DNA. Mỗi đoạn DNA chứa trong vector của thư viện được gọi là một dòng (clone). Tùy thuộc vào kích thước của các đoạn DNA mà chọn vector là phage (có thể chứa đoạn DNA dài từ 15-23 kb), cosmid (45 kb) hay BAC (>100 kb).
Có thể sử dụng DNA tách từ các mô khác nhau để xây dựng thư viện genomic DNA. Các thư viện genomic DNA của một cơ thể chỉ chứa các đoạn DNA dài ngắn khác nhau nhưng thông tin di truyền không thay đổi. Ngược lại, thư viện cDNA được xây dựng từ các mRNA. Trong cơ thể có những gen chỉ hoạt động trong những loại tế bào nhất định, do đó giữa các mô khác nhau có thể thu được các phân tử mRNA khác nhau. Vì vậy, một cơ thể có nhiều thư viện cDNA khác nhau đặc trưng cho từng loại tổ chức chuyên hóa (xem chương 6).