cách dùng mã di truyền, từ các vùng ngắn của chuỗi amino acid đã biết của protein quan tâm. Do sự thoái biến (degeneracy) của mã di truyền, chuỗi amino acid đề xuất có thể không được đặc trưng chính xác bởi các oligonucleotide đơn được dự đoán cho trình tự. Mặc dù, trong rất nhiều trường hợp, trình tự các amino acid giống nhau có thể được đặc trưng bởi nhiều oligonucleotide khác nhau. Không có cách nào để biết chắc chắn các oligonucleotide này trên thực tế có được dùng trong gen quan tâm hay không. Ba giải pháp được đưa ra cho vấn đề này là như sau:
+ Một họ oligonucleotide có thểđược tổng hợp chứa tất cả các trình tự có khả năng mã hóa cho một trình tựđã cho của chuỗi amino acid. Số lượng các thành viên trong họ này tùy thuộc vào mức độ thoái biến của mã bộ ba cho các amino acid đặc biệt. Tuy nhiên, do tất cả các trình tự oligonucleotide có khả năng được hiện diện, nên ít nhất một trong số các thành viên sẽ tương hợp với dòng cDNA quan tâm. Duy trì kích thước của mỗi họ trong tỷ lệ dễ sử dụng, các oligonucleotide ngắn (14-17 base) thường được sử dụng, một kích thước tối thiểu được tiến hành cho phản ứng lai.
+ Oligonucleotide dài hơn (40-60 base) của trình tự duy nhất có thể được tổng hợp bằng cách dùng các mã bộ ba được sử dụng phổ biến nhất cho mỗi amino acid (tránh dùng dinucleotide CpG, vì nó được hiện diện lại trong hầu hết các cDNA của eukaryote). Tất nhiên, oligonucleotide này sẽ không tương hợp một cách chính xác với trình tự trong cDNA, nhưng nó sẽ cố định đủ tốt để phát hiện bằng cách lai dưới các điều kiện không nghiêm ngặt (non-stringency).
+ Một oligonucleotide có thể được tổng hợp chứa một base như là inosine ở các vị trí thoái biến tiềm tàng. Inosine có thể bắt cặp với tất cả bốn loại base truyền thống mà không làm tổn thương nghiêm trọng khả năng ổn định của các thể lai có kết quả. Vì thế, nó có khả năng sản sinh ra các họ oligonucleotide dài hơn được làm giảm số lượng và còn lai với gần như tất cả các dòng cDNA có thể mã hóa cho protein quan tâm.
Cuối cùng, nếu trình tự protein có sẵn từđầu tận cùng amino của protein, thì thư viện cDNA được sàng lọc phải có chất lượng cao để chắc chắn rằng hầu hết đầu tận cùng 5’ của mRNA được đại diện. 1.2. Phát hiện miễn dịch các kháng nguyên đặc hiệu
Các thư viện cDNA được xây dựng trong các vector biểu hiện như lgt11, lgt18-23, lZAP... có thể được sàng lọc bằng kháng thể theo hướng chống lại protein quan tâm. Các màng lọc nitrocellulose in các vết tan của vi khuẩn được ngâm trong dung dịch chứa kháng thể. Sau khi rửa, màng lọc được ủ với protein
A của Staphylococcus aureus hoặc bằng kháng thể thứ hai theo hướng chống lại các yếu tố quyết định kháng nguyên đặc hiệu loài của kháng thể thứ nhất. Ở các mô tả đầu tiên của phương pháp này, phối tử (ligand) thứ hai được đánh dấu đồng vị phóng xạ với 125I. Ngày nay, phối tử thứ hai được liên kết hóa trị với enzyme mà hoạt tính của enzyme có thể được phát hiện bằng hóa tổ chức học (ví dụ: alkaline phosphatase).
Chìa khóa thành công của phương pháp này nằm trong chất lượng của kháng thể. Điều cần thiết là kháng thể nhận diện được protein bị biến tính (Ví dụ: nó phải cho các tín hiệu mạnh trong phân tích Western blot-xem chương 7). Hơn nữa, quá trình sàng lọc được tiến hành dễ dàng hơn và mẫn cảm hơn nếu kháng thể được bắt nguồn từ huyết thanh đa dòng (polyclonal antiserum) độ chuẩn cao. Bởi vì các huyết thanh như thế phản ứng bình thường với nhiều yếu tố quyết định kháng nguyên khác nhau, cơ hội để phát hiện dòng cDNA biểu hiện đoạn protein quan tâm được tăng lên. Các huyết thanh đa dòng thường chứa các kháng thể phản ứng chéo nhận diện các thành phần không tái tổ hợp của vi khuẩn tiềm tan và chúng phải được loại bỏ trước khi quá trình sàng lọc được thực hiện.
Phản ứng liên kết không đặc hiệu sẽ thấp hơn nhiều khi sử dụng kháng thể đơn dòng làm mẫu dò. Tuy nhiên, số lượng các thể tái tổ hợp có thểđược phát hiện cũng bị giảm bởi vì mỗi kháng thểđơn dòng riêng biệt có thể phản ứng với chỉ một yếu tố quyết định kháng nguyên đơn. Vì thế, mẫu dò miễn dịch lý tưởng có thể chứa một hỗn hợp của nhiều kháng thể đơn dòng khác nhau, mà mỗi kháng thể phản ứng mạnh với protein bị biến tính.
2. Các phương pháp xác nhận các dòng cDNA
Các thư viện cDNA thường được dàn trải ở mật độ cao để sàng lọc với kháng thể hoặc các mẫu dò của nucleic acid, và mỗi dòng phản ứng dương tính trong vòng đầu tiên đòi hỏi một số chu kỳ dàn trải và sàng lọc bổ sung trước khi chúng được xem như thuần khiết. Tuy nhiên, khả năng phản ứng thích hợp với mẫu dò đặc biệt là không đầy đủđể chứng minh dòng cDNA thu được bắt nguồn từ mRNA quan tâm. Sự chứng minh chỉ tuyệt đối khi cho thấy dòng cDNA chứa một khung đọc mở mã hóa cho trình tự amino acid hoàn toàn của protein. Một số vấn đề sau cần được lưu ý đểđảm bảo mức độ chính xác của các dòng cDNA thu được:
- Biểu hiện của protein từ cDNA hoàn chỉnh trong các tế bào prokaryote hoặc eukaryote thể hiện các hoạt tính sinh học hoặc enzyme chính xác.
- Sự tương ứng giữa các phần của chuỗi nucleotide của cDNA và các chuỗi amino acid của các peptide có nguồn gốc từ protein được tinh sạch.
- Sự tương ứng giữa các bản đồ peptide của chuỗi polypeptide được tổng hợp in vitro bằng sự phiên mã của dòng cDNA và các bản đồ peptide của protein đích thực.
- Sự kết tủa miễn dịch của polypeptide được tổng hợp in vitro hoặc in vivo từ sự phiên mã dòng cDNA bằng các kháng thể được tăng khả năng chống lại protein quan tâm. Sự chặt chẽ của thử nghiệm này tăng lên khi nó được tiến hành bởi một chuỗi các kháng thểđơn dòng xác nhận các yếu tố quyết định kháng nguyên khác nhau trên phân tử protein.
- Kết tủa miễn dịch protein đích thực với các kháng thể tăng khả năng chống lại các peptide tổng hợp mà các trình tự của chúng được xác định bởi trình tự nucleic acid của cDNA được tạo dòng.