DNA được tạo dòng trong các vector có nguồn gốc plasmid hoặc các vector nhiễm sắc thể nhân tạo (BAC, YAC) sản xuất ra các khuẩn lạc (vi khuẩn hoặc nấm men) khi các nuôi cấy biến nạp được dàn
mỏng trên đĩa agar chứa môi trường sinh trưởng và nuôi dưới những điều kiện thích hợp. Trong khi đó, các vector có nguồn gốc virus (bacteriophage) sẽ sinh tan tế bào bị chúng xâm nhiễm và sản xuất ra các plaque (vết tan) có dạng hình tròn chu vi khoảng 2-3 mm có màu sáng trên thảm vi khuẩn (bacterial lawn) của đĩa agar (Hình 5.7).
Hình 5.7. Các vết tan của phage l trên thảm vi khuẩn E. coli. Các phage l được trộn với các tế bào E. coli trong môi trường nuôi rồi dàn mỏng (plating) lên đĩa petri chứa bottom agar (nuôi cấy top agar). Sau khi ủ qua đêm ở 37oC, các tế bào vi khuẩn mọc tạo nên thảm vi khuẩn, ở trên đó các vùng bị nhiễm phage l hình thành nên các vết trong, do hiện tương sinh tan vi khuẩn của phage, gọi là vết tan.
Các vector, như mô tảở trên, thường chứa các gen chỉ thị cho phép chọn lọc những tế bào vật chủ mang vector (thể biến nạp). Thông thường các chỉ thị này là gen kháng kháng sinh và các tế bào biến nạp sinh trưởng trên môi trường chứa kháng sinh tương ứng.
Ngoài ra, các vector còn chứa các gen bổ sung để phân biệt các tế bào biến nạp chứa đoạn chèn của DNA ngoại lai với các tế bào chứa các vector tự tái tạo lại vòng. Ví dụ: vector mã hóa gen β-galactosidase xúc tác sản sinh ra các sản phẩm màu xanh từ cơ chất không màu X-gal cho kết quả sinh trưởng của các khuẩn lạc màu xanh. Đoạn chèn của DNA ngoại lai đã làm mất hoạt tính của gen cho kết quả sản xuất ra các khuẩn lạc màu trắng.
Một dòng chứa các chuỗi DNA quan tâm đặc biệt có thểđược xác định bởi lai khuẩn lạc. Một lượng nhỏ khuẩn lạc biến nạp hoặc vết tan được chuyển lên màng nitrocellulose hoặc nylon đã được phủ lên (overlay) trên đĩa agar trước đó. DNA được biến tính và cốđịnh trên màng bằng cách đun nóng (baking) hoặc chiếu tia cực tím (UV-crosslinking), và sau đó được lai trong đệm chứa mẫu dò được đánh dấu đồng vị phóng xạ có trình tự bổ sung một phần của chuỗi được xác định. Ví dụ: Có thể một oligonucleotide tổng hợp nhân tạo, có nguồn gốc từ genomic DNA từng phần, cDNA hoặc chuỗi protein hoặc sản phẩm PCR. Một vài trường hợp mẫu dò có thể được thiết kế dựa trên trình tự bắt nguồn từ gen tương đồng của các loài khác và thường được lai với cường lực thấp. Các mẫu dò thừa được rửa khỏi màng để ủ với phim X-quang. Theo hướng của phim (sau khi rửa) với sựđối chiếu đĩa agar gốc, sau đó sẽ có khả năng gắn kết các khuẩn lạc thực tế với các khuẩn lạc lai dương tính tương ứng trên phim X-quang (Hình 5.8).
Hình 5.8. Sàng lọc (screening) thư viện gen trong khuẩn lạc vi khuẩn hoặc vết tan của bacteriophage l
Gần đây, một phương pháp sàng lọc khác đã được thiết kế. Theo hướng này các khuẩn lạc vi khuẩn hoặc nấm men được nhặt riêng rẽ và chấm ngay ngắn thành hàng lên màng hoặc trong giếng của đĩa microtiter. Mỗi dòng có thểđược xác định bằng tọa độđường kẻ riêng rẽ của nó. So với các phương pháp truyền thống, phương pháp mới này dễ dàng hơn trong việc tựđộng hóa, sắp xếp các thư viện và đối chiếu số liệu giữa các phòng thí nghiệm khác nhau.
Nếu dòng mong muốn biểu hiện một protein đặc biệt hoặc một đoạn protein, thì sau đó bằng cách xây dựng thư viện với một vector biểu hiện chứa các tín hiệu phiên mã và dịch mã người ta có thể sàng lọc trực tiếp đối với protein được biểu hiện. Ví dụ: nếu protein tương ứng đầy đủ là thích hợp, thì kháng thể đặc hiệu có thể được tạo ra, được đánh dấu và sử dụng để phát hiện yếu tố quyết định kháng nguyên trên protein được biểu hiện từ các khuẩn lạc được dung ly. Nếu đoạn chèn được yêu cầu mã hóa một hoạt tính sinh học, thì sau đó việc sàng lọc có thểđược thực hiện bằng các thử nghiệm cho hoạt tính đó, hoặc bằng cách chọn lọc trực tiếp, ví dụ: chọn lọc trên môi trường sinh trưởng không hoàn chỉnh đối với enzyme sinh tổng hợp cần thiết cho sự sinh trưởng. Tuy nhiên, các hướng dựa trên sự biểu hiện nói chung dễứng dụng cho thư viện cDNA hơn là thư viện genomic DNA.