1. Thành phần phản ứng
- Phân tử DNA có chứa đoạn DNA cần khuếch đại - 2 primer (F và R)
- Taq pol - 4 loại dNTP
Hình 3.5. Sơđồ kỹ thuật PCR mỏ neo
2. Thực hiện phản ứng
Dưới đây là ví dụ minh họa cho một phản ứng khuếch đại:
2.1. Chuẩn bị dung dịch master mix và cho vào eppendorf tube (E-tube) loại 0,5 mL, trộn đều các thành phần sau: Đệm 10× PCR 4,5 mL Hỗn hợp 4 dNTP (2,5 mM mỗi loại) 4 mL Primer-F (10 pmol/mL) 2,5 mL Primer-R (10 pmol/mL) 2,5 mL Thêm H2O tới 40 mL
2.2. Chuẩn bị dung dịch pha loãng của Taq pol:
Đệm ×10 2 mL
Taq pol (5 units/mL) 1 mL
Hình 3.6. Sơđồ kỹ thuật PCR đảo ngược
2.3. Bổ sung 5 mL DNA khuôn mẫu (100 ng) vào 40 mL dung dịch của master mix tube. 2.4. Bổ sung 2 mL/1 tube dung dịch pha loãng của Taq pol.
2.5. Đặt E-tube đựng dung dịch phản ứng vào heating block của máy PCR để thực hiện chếđộ nhiệt theo chu kỳ như sau:
- Start program - 95oC/5 phút
- Thực hiện 30 chu kỳ: 95oC/30 giây, 50oC/30 giây và 72oC/1 phút - 72oC/10 phút
- Giữ sản phẩm PCR ở 4oC
- Chạy điện di để kiểm tra kết qủa PCR (Hình 3.7)
- Nếu chưa chạy điện di thì bảo quản sản phẩm PCR ở -20oC
Chú ý
- Các thành phần và điều kiện của phản ứng như: Độ dài của primer, chế độ nhiệt trong một chu kỳ, số chu kỳđối với mỗi đối tượng có thể thay đổi ít nhiều bằng thực nghiệm. Các thông số trên chỉ có ý nghĩa tham khảo. đối với mỗi đối tượng có thể thay đổi ít nhiều bằng thực nghiệm. Các thông số trên chỉ có ý nghĩa tham khảo.