1. Các bacteriophage l vector được dùng phổ biến
Hai loại vector biểu hiện của bacteriophage l thường dùng để xây dựng thư viện cDNA là lgt10 và lgt11. Vector lgt10 dùng để xây dựng các thư viện chỉđược sàng lọc bằng các mẫu dò nucleic acid, trong khi vector lgt11 dùng để xây dựng các thư viện được sàng lọc bằng các mẫu dò miễn dịch để phân lập các chuỗi DNA mã hóa các kháng nguyên đặc hiệu.
1.1. Vector lgt10
lgt10 là vector được thiết kếđể nhận các đoạn DNA ngoại lai trong vùng mã hóa của gen ức chếcI2. Các vector này mang gen cI, giống như bacteriophage l, nó tạo thành các vết tan mờđục trên hầu hết các chủng E. coli. DNA của lgt10 mang vị trí nhận biết đơn EcoRI nằm trong vùng mã hóa của gen cI là nơi mà các đoạn DNA có thể gắn vào. Kết quả chèn đoạn DNA sẽ làm bất hoạt gen cI, sản sinh ra các bacteriophage cI tái tổ hợp và tạo thành các plaque màu sáng, dễ dàng phân biệt với các plaque mờđục của lgt10 bố mẹ.
DNA của lgt10 bố mẹ xấp xỉ 43 kb và như vậy có thể nhận các đoạn DNA ngoại lai dài tới 7,6 kb. Các thư viện cDNA được xây dựng trong lgt10 luôn chứa hỗn hợp các bacteriophage tái tổ hợp và không tái tổ hợp. Hai loại bacteriophage này có thể phân biệt kiểu hình nhờ vào khả năng tạo thành các plaque
của chúng. 1.2. Vector lgt11
lgt11 là vector biểu hiện mang bản sao của gen lacZ của E. coli, có vị trí nhận biết đơn EcoRI nằm ở vùng ngược hướng 53 bp của codon kết thúc dịch mã của gen lacZ. DNA ngoại lai có kích thước xấp xỉ 7,2 kb có thểđược gắn ở vị trí này. Các chuỗi mã hóa gắn trong khung đọc theo hướng chính xác sẽđược biểu hiện để sản xuất các protein dung hợp (fusion protein) có đầu tận cùng amino chứa các chuỗi b-galactosidase và đầu tận cùng carboxyl chứa mạch polypeptide ngoại lai. Một số protein dung hợp này sẽ thể hiện các yếu tố quyết định kháng nguyên (epitopes) được phát hiện bởi khả năng phản ứng với các kháng thể của chúng.
Các protein dung hợp mang các yếu tố quyết định kháng nguyên ngoại lai có thể được phát hiện bằng cách sàng lọc các plaque với mẫu dò miễn dịch. Bacteriophage được dàn trải ở 42oC trên E. coli. Sau khoảng 4 giờ, các đĩa petri được chuyển đến nhiệt độ 37oC và được phủ màng lọc vô trùng nitrocellulose có thấm isopropylthio-b-D-galactoside (IPTG), chất làm bất hoạt gen ức chếlac và cảm ứng biểu hiện protein ngoại lai. Sau một vài giờ nuôi ở 37oC, các màng lọc được ủ với kháng thể để liên kết với kháng nguyên quan tâm. Các kháng thể này sau đó được phát hiện bằng các xét nghiệm hóa học phóng xạ (radiochemistry) hoặc hóa học mô (histochemistry).
2. Một số bacteriophage l vector khác
2.1. Vector lgt18 và lgt19
Hai loại vector lgt18 và lgt19 có nguồn gốc từ vector lgt11 được cải tiến mang vùng tạo dòng (polycloning sites) ở vị trí EcoRI đơn của lgt11. Có thể sử dụng hai loại vector này để tạo dòng định hướng và không định hướng cDNA. Hơn nữa, ít nhất một trong các vị trí của vùng tạo dòng (SalI) ít khi xuất hiện trong DNA động vật có vú (trung bình 1 vị trí/đoạn 100 kb), và vì thế ít có khả năng các dòng cDNA có chứa vị trí SalI. Như vậy, các cDNA sợi đôi có đầu bằng mang các linker SalI không cần phải được bảo vệ bằng cách methyl hóa (methylation) trước khi được thủy phân bằng RE. Khi các đoạn linker được loại bỏ, sẽ dẫn đến kết quả quần thể các phân tử cDNA có thểđược gắn trực tiếp với các nhánh của lgt18 hoặc lgt19.
2.2. Vector lgt20 và lgt21
Các vector lgt20 và lgt21 có nguồn gốc tương ứng từ lgt18 và lgt19, và như vậy có nhiều tính chất giống nhưđã mô tảở lgt18 và lgt19. Những thay đổi đặc biệt so với lgt18 và lgt19 như sau:
- Vị trí tổng hợp chiđược đưa vào vector cho phép loại bỏ sự chọn lọc đoạn chèn cDNA chứa các vị trí chi.
- Các vị trí SacI và XbaI được loại bỏ khỏi các nhánh của vector sao cho vị trí XbaI ở trong vùng tạo dòng là duy nhất, các thao tác này làm khuyết một đoạn khoảng 500 bp trong DNA của bacteriophage l ở phía bên phải gen lac5. Đặc điểm này cho phép nhận các đoạn chèn DNA lớn hơn (tới 8,2 kb) so với các vector lgt18 và lgt19.
2.3. Vector lgt22 và lgt23
Các vector này cũng bắt nguồn từ lgt18 và lgt19, mang trình tự tổng hợp chi và các vị trí tạo dòng trong một khung khác gần đầu 3’ của vùng mã hóa gen lacZ. Các vector lgt22 và lgt23 giống hệt nhau ngoại trừ hướng của các vị trí tạo dòng. Các vị trí XbaI và SacI ở các nhánh của lgt18 và lgt19 bị loại bỏ, như vậy các vector này chỉ mang năm vị trí cắt hạn chế duy nhất để tạo dòng là: NotI, XbaI, SacI, SalI và
EcoRI. Các đoạn cDNA gắn vào một trong năm vị trí có thể được biểu hiện như là một protein dung hợp LacZ. Các vector lgt22 và lgt23 được thiết kếđể cho phép tạo dòng định hướng cDNA vào trong các vị trí
SalI và NotI. Tổng hợp sợi thứ nhất và thứ hai của cDNA bằng phương pháp primer-linker cho phép cDNA sợi đôi được cắt bằng SalI và NotI và gắn trực tiếp trong các nhánh của vector theo hướng liên quan với promoter lacZ. Một trong ba thể tái tổ hợp sẽ mang phân tử cDNA trong khung đọc chính xác để sản xuất protein dung hợp.
2.4. Vector lZAP
Vector lZAP mang vùng tạo dòng cùng hướng với promoter lacZ của E. coli. Đoạn cDNA dài 10 kb có thểđược gắn vào trong các vị trí này và biểu hiện hoặc trong vi khuẩn được xâm nhiễm hoặc trong các thể tiềm tan được cảm ứng, như mô tảở lgt11. Hơn nữa, các protein dung hợp lZAP có thểđược biểu hiện từ các plasmid có số lượng bản sao lớn. Vector lZAP có một sốđặc điểm như sau:
- Có sáu vị trí RE trong vùng tạo dòng được sử dụng để tạo dòng định hướng các phân tử cDNA, trong đó có một vị trí cắt EcoRI tương tự như lgt11.
- Có các promoter của bacteriophage T3 và T7 nằm bên cạnh vùng tạo dòng.
- Có các trình tự có nguồn gốc từ bacteriophage f1 để chuyển đổi in vivo đoạn chèn DNA từ bacteriophage l vector tới Bluescript plasmid, các trình tự của nó được chứa trong lZAP. Quá trình cắt bỏ được thực hiện dễ dàng nhờ sự bố trí các trình tự của bacteriophage f1 (khởi đầu tổng hợp DNA sợi đơn) về một phía của Bluescript plasmid DNA mang vùng tạo dòng và sự bố trí các trình tự bacteriophage f1 (kết thúc tổng hợp DNA sợi đơn) về một phía khác của plasmid DNA.
Vector lZAP là dạng đầu tiên của vector thế hệ mới được thiết kế nhằm cung cấp một trình tự các vị trí tiềm năng để tạo dòng và biểu hiện cDNA, một phương pháp tiện lợi và đơn giản để thu hồi và thực hiện các thao tác tiếp theo của cDNA. Do tính linh hoạt của chúng, các vector này thay thế cho lgt10 và lgt11 và được xem là vector thích hợp để xây dựng các thư viện cDNA. Vector lZAPII cũng tương đồng với lZAP.
VI. Nhận dạng các dòng cDNA quan tâm
1. Các phương pháp sàng lọc
Có ba phương pháp sàng lọc thư viện cDNA cho các dòng quan tâm: - Lai nucleic acid.
- Phát hiện các kháng nguyên miễn dịch đặc hiệu. - Chọn lọc sib các dòng cDNA.
Dưới đây chỉ trình bày hai phương pháp phổ biến đó là lai nucleic acid và phát hiện các kháng nguyên miễn dịch đặc hiệu.
1.1. Lai nucleic acid
Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến và đáng tin cậy nhất khi sàng lọc các thư viện cDNA để tìm kiếm các dòng quan tâm. Sàng lọc bằng phương pháp lai nucleic acid cho phép phân tích đồng thời nhiều dòng và nhanh, không đòi hỏi các dòng cDNA phải hoàn chỉnh và sản phẩm được tổng hợp trong tế bào vật chủ phải có hoạt tính sinh học hoặc kháng nguyên. Hơn nữa, cơ sở lý thuyết của kỹ thuật lai nucleic acid đã được hiểu biết đầy đủ. Điều này cho phép phát triển một số lượng lớn các kỹ thuật khác nhau có thểđiều chỉnh các mẫu dò của nucleic acid có các chiều dài và đặc điểm khác nhau.
- Các mẫu dò tương đồng. Các mẫu dò tương đồng chứa ít nhất một phần của chuỗi nucleic acidchính xác của dòng cDNA mong muốn. Chúng được dùng trong nhiều trường hợp khác nhau, ví dụ: khi