Phương pháp tổng hợp cDNA có nhiều thuận lợi do: (1) Lấy mRNA đúng của gen. (2) Không tốn công phân tích những đoạn gen trùng lặp. (3) Chọn lọc dễ dàng trong một số trường hợp.
Ở đây chỉ trình bày phương pháp tổng hợp cDNA. Quá trình tổng hợp cDNA qua ba giai đoạn như sau: (1) Tổng hợp sợi thứ nhất bằng enzyme reverse transcriptase. (2) Biến tính và cắt RNA trong thể lai mRNA-cDNA tuần tự bằng nhiệt và enzyme RNase H của E. coli. Thay thế khuôn mẫu là chuỗi RNA bằng chuỗi cDNA thứ nhất và tổng hợp sợi cDNA thứ hai nhờ DNA polymerase I của E. coli. (3) Cắt vòng cặp tóc của cDNA sợi đôi nhờ nuclease S1 và sửa chữa hai đầu bằng đoạn Klenow (Hình 6.4).
1. Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất
1.1. Enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase)
Nhân tố quan trọng nhất trong tổng hợp cDNA là chất lượng của enzyme phiên mã ngược được sử dụng trong phản ứng. Mặc dù chất lượng của enzyme được sử dụng nói chung là tốt, song vẫn khó loại trừ được RNase bẩn. Trở ngại này có thể khắc phục bằng cách dùng các nhân tố ức chế mạnh RNase (RNase inhibitor), ví dụ như: vanadyl-ribonucleoside hoặc RNasin, trong phản ứng phiên mã ngược.
Tỷ lệ enzyme phiên mã ngược dùng cho khuôn mẫu mRNA cũng có ảnh hưởng khác nhau đến hiệu suất tổng hợp cDNA hoàn chỉnh. Nếu số lượng khuôn mẫu nhiều thì hiệu suất của sản phẩm phiên mã cDNA sẽ tăng lên cùng với việc tăng số lượng enzyme reverse transcriptase. Trong nghiên cứu, hiệu suất tối đa của các sản phẩm phiên mã cDNA hoàn chỉnh đạt đến 80 tiểu phần enzyme/mg của khuôn mẫu, tỷ lệ enzyme cao như thế đòi hỏi phải sử dụng enzyme tinh sạch cao và bao gồm cả các nhân tốức chế RNase trong phản ứng.
1.2. Oligo dT primer
Các oligo dT primer được sử dụng để làm mồi cho phản ứng tổng hợp sợi cDNA thứ nhất dựa trên khuôn mẫu của mRNA. Các oligo dT primer sẽ liên kết với đuôi polyA của mRNA.
1.3. Deoxynucleoside triphosphate (dNTP)
Nồng độ của bốn loại dNTP là yếu tố đặc biệt quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp cDNA. Nếu nồng độ của một trong bốn dNTP giảm xuống dưới 10-50 mM thì hiệu suất của sản phẩm phiên mã giảm rõ rệt. Khi sử dụng RNA của avian myeloblastosis virus làm khuôn mẫu thì việc sản xuất các cDNA hoàn chỉnh tăng tối đa ở nồng độ 75 mM của cả bốn loại dNTP. Nồng độ của dNTP từ 200-250 mM đang được dùng phổ biến.
1.4. Các cation hóa trị 1 và hóa trị 2
Các điều kiện ion ảnh hưởng thật sự đến hiệu quả phiên mã của các khuôn mẫu khác nhau. Đối với các sản phẩm phiên mã dài thì ion K+ có hiệu quả cao hơn ion Na+. Nồng độ K+ tối ưu cho quá trình tổng hợp và kéo dài kích thước cDNA là khoảng từ 140-150 mM. Các cation hóa trị 2 là yêu cầu tuyệt đối cho hoạt tính của enzyme phiên mã ngược. Không có hoạt tính nào được tìm thấy ở nồng độ <4 mM của ion Mg2+, nồng độ ion Mg2+ tối ưu cho quá trình sản xuất các sản phẩm phiên mã hoàn chỉnh là khoảng 6-10 mM.
1.5. pH của dung dịch phản ứng
Giá trị pH 8,3 là tối ưu để sản xuất hiệu quả các sản phẩm phiên mã cDNA hoàn chỉnh. Trong quá trình sản xuất các sản phẩm phiên mã, một số đệm đã được thử nghiệm nhưng không tốt hơn đệm Tris.HCl.
2. Tổng hợp sợi cDNA thứ hai
Gây biến tính (đun sôi) thể lai mRNA-cDNA để cắt RNA bằng RNase H của E. coli. Thông thường, đầu tận cùng 3’ của các cDNA sợi đơn có khả năng tạo thành các cấu trúc vòng cặp tóc (hairpin loop)1 và vì thế có thể được sử dụng để làm mồi (primer) cho quá trình tổng hợp sợi cDNA thứ hai bằng DNA
polymerase I của E. coli hoặc reverse transcriptase (Hình 6.4). Mặc dù người ta đã dựđoán cấu trúc vòng đôi ởđầu tận cùng của các cDNA và cơ chế phát sinh của chúng, nhưng hiện tượng tổng hợp sợi cDNA thứ hai vẫn chưa được nghiên cứu một cách hệ thống.
Tổng hợp sợi cDNA thứ hai bằng DNA polymerase I đã được sử dụng rộng rãi. Đoạn Klenow của DNA polymerase I thiếu hoạt tính exonuclease 5'-3' cũng được sử dụng thành công để tổng hợp sợi cDNA thứ hai.
Nhiều tác giảđã sử dụng reverse transcriptase để tổng hợp sợi cDNA thứ hai. Mặc dù có tác giả cho rằng AMV reverse transcriptase không thể dùng để tổng hợp sợi thứ hai của cDNA immunoglobulin, nhưng thành công của nhiều thí nghiệm dùng reverse transcriptase để tổng hợp sợi cDNA thứ hai đã cho thấy việc sử dụng cả hai enzyme đều có thể cho kết quả tốt. DNA polymerase I và reverse transcriptase có thể tạm ngừng hoặc ngừng lại ở các chuỗi khác nhau. Vì vậy, các sợi thứ hai được tổng hợp một cách đặc biệt, chúng được sản xuất nhờ một enzyme và được mở rộng hoàn toàn nhờ một enzyme khác.
Hình 6.4. Sơđồ tổng hợp đoạn cDNA từ khuôn mẫu mRNA
3. Cắt vòng cặp tóc nhờ nuclease S1
Sau khi tổng hợp cDNA hoàn toàn, sợi thứ nhất và thứ hai được liên kết cộng hóa trị bởi vòng cặp tóc và vòng cặp tóc dễ bị cắt bởi nuclease S1. Sau đó, đoạn cDNA được sửa chữa bằng enzyme Klenow, kết quả là hai đầu tận cùng là đầu bằng.
Sợi đôi cDNA sau đó được tách thành các tiểu phần theo kích thước và các phân tử lớn nhất được gắn vào các plasmid của vi khuẩn. Hoặc là một tập hợp đầy đủ các kích thước của cDNA sợi đôi được tạo dòng trong bacteriophage lđể xây dựng thư viện cDNA (cDNA library). Tuy nhiên, việc đưa các đầu bằng vào vector sẽ gây khó khăn trong việc lấy chúng ra khỏi vector một cách nguyên vẹn sau này. Do đó các linker thường được nối vào hai đầu của các cDNA nhờ DNA ligase. Linker là những đoạn nucleotide ngắn có chứa vị trí nhận biết của một loại RE (ví dụ: EcoRI) được tổng hợp nhân tạo tương ứng với vị trí nhận biết RE (ví dụ: EcoRI) của vector. Sau đó, các cDNA mang linker và vector sẽ được cắt bởi cùng một
enzyme (ví dụ: EcoRI). Nhờđó các cDNA và vector đều có đầu sole tương đồng (đầu dính) và cDNA sẽ dễ dàng gắn cũng như lấy ra khỏi vector một cách nguyên vẹn.