(Các kỹ thuật được thực hiện tại Trung tâm Cúm Quốc gia, Viện VSDTTƯ)
Lựa chọn 75 chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc sử dụng trong nghiên cứu đƣợc thu thập theo sơ đồ sau:
Sau 42 – 72h khuếch đại Gây nhiễm trên tế bào MDCK
Hiệu giá NKHC HA ≥ 8 Thu thập, lựa chọn chủng (75 chủng) Dịch họng/dịch phế quản (+) A/H1N1/09 đại dịch bằng RT-PCR Hiệu giá KN (Phản ứng NNKHC - HI) Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển Giải trình tự chuỗi Nucleotide của 6 gen HA, NA, PB1, PB2, NS và M Mục tiêu 1: Phân tích đặc điểm di truyền học của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam giai đoạn 2009 – 2013. Mục tiêu 2: Xác định đặc tính kháng nguyên của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09. Mục tiêu 3: Đề xuất chủng vi rút dự tuyển cho vắc xin cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam
Sau 42 – 72h khuếch đại Gây nhiễm trên tế bào MDCK
Hiệu giá NKHC HA ≥ 8 Thu thập, lựa chọn chủng (75 chủng) Dịch họng/dịch phế quản (+) A/H1N1/09 đại dịch bằng RT-PCR Hiệu giá KN (Phản ứng NNKHC - HI) Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển Giải trình tự chuỗi Nucleotide của 6 gen HA, NA, PB1, PB2, NS và M Mục tiêu 1: Phân tích đặc điểm di truyền học của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam giai đoạn 2009 – 2013. Mục tiêu 2: Xác định đặc tính kháng nguyên của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09. Mục tiêu 3: Đề xuất chủng vi rút dự tuyển cho vắc xin cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam
Sau 42 – 72h khuếch đại Gây nhiễm trên tế bào MDCK
Hiệu giá NKHC HA ≥ 8 Thu thập, lựa chọn chủng (75 chủng) Dịch họng/dịch phế quản (+) A/H1N1/09 đại dịch bằng RT-PCR Hiệu giá KN (Phản ứng NNKHC - HI) Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển Giải trình tự chuỗi Nucleotide của 6 gen HA, NA, PB1, PB2, NS và M Mục tiêu 1: Phân tích đặc điểm di truyền học của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam giai đoạn 2009 – 2013. Mục tiêu 2: Xác định đặc tính kháng nguyên của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09. Mục tiêu 3: Đề xuất chủng vi rút dự tuyển cho vắc xin cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam
Sau 42 – 72h khuếch đại
Gây nhiễm trên tế bào MDCK
Hiệu giá NKHC HA ≥ 8 Thu thập, lựa chọn chủng (75 chủng) Dịch họng/dịch phế quản (+) A(H1N1)pdm09 bằng RT-PCR Hiệu giá KN (Phản ứng NNKHC - HI) Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển Giải trình tự chuỗi Nucleotide của 6 gen HA, NA, PB1, PB2, NS và M Mục tiêu 1: Phân tích đặc điểm di truyền học của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam giai đoạn
2009 – 2013. Mục tiêu 2: Xác định đặc tính kháng nguyên của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09. Mục tiêu 3: Đề xuất chủng vi rút dự tuyển cho vắc xin cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam
2.2.5.1 Phân lập, khuếch đại và lựa chọn chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09
Sau khi xác định bệnh phẩm nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 bằng phƣơng pháp RT-PCR hoặc real time RT-PCR. (Xem phần phụ lục)
Phân lập vi rút:
Sinh phẩm cho phƣơng pháp phân lập vi rút
Sinh phẩm Xuất xứ
Tế bào thận chó MDCK
(Madin-Darby Canine Kidney) CDC
Chai nuôi cấy tế bào T-25 Corning Cat.No. 430720 Dulbecco’s Modified Eagle
Medium (D-MEM) GIBCO Cat.No. 11965-092
Penicillin-Streptomycin, dạng dung dịch đặc (10,000 U/ml penicillin G; 10,000 μg/ml streptomycin sulfate)
GIBCO Cat.No. 15140-023
Dung dịch Bovine serum albumin
fraction V, 7.5% GIBCO Cat.No. 15260-011
Fetal bovine serum, 40 nm filtered HyClone Laboratories, Inc Cat.No. A-1111-L
Trypsin-EDTA (0.05% trypsin;
0.53 mM EDTA.4Na) GIBCO Cat.No. 25300-054
Trypsin, TPCK Sigma Cat.No. T-8642
Gentamicin reagent dạng dung dịch
(50 mg gentamicin sulfate/ml) GIBCO Cat.No 15750-011
Cồn (96-100%) Merck Cat.No.1.00983.1000
Chuẩn bị dụng cụ, vật liệu.
- Lựa chọn tế bào MDCK mọc đẹp thành một lớp trong chai nuôi cấy tế bào 25 cm2 (Corning Cat.No. 430720).
- Dung dịch phát triển gồm: D-MEM x10, Fetal Bovine Serum 7,5%, Penicillin 100 U/ml và Streptomycin 100 µg/ml, NaHCO3 và nƣớc cất hai lần vô trùng.
- Dung dịch môi trƣờng nuôi cấy vi rút gồm: D-MEM x10, Bovine serum albumine 2%, Penicillin 100 U/ml và Streptomycin 100 µg/ml, TPCK- treated trypsin và nƣớc cất hai lần vô trùng.
- Trypsin treated - TPCK
Chuẩn bị Trypsin treated - TPCK
- Kháng sinh để xử lý bệnh phẩm: Kanamycin sulfate; Cipro-HCl - Xử lý mẫu bệnh phẩm lâm sàng
(1). Trộn đều bệnh phẩm bằng máy vortex. Loại bỏ tăm bông ngoáy họng. (2). Thêm 20 µl kháng sinh xử lý bệnh phẩm.
(3). Để tại nhiệt độ phòng 30-45 phút. (4). Sử dụng mẫu để phân lập.
- Phân lập trên tế bào MDCK
(1). Chọn chai tế bào MDCK 25 cm2 mọc đẹp 1 lớp.
(2). Loại bỏ môi trƣờng phát triển, rửa tế bào 2 lần bằng PBS (-) và 1 lần bằng môi trƣờng D-MEM chứa 2 µg/ml TPCK trypsin.
(3). Gây nhiễm 250 µl bệnh phẩm, ủ 370C/60 phút
(4).Thêm 1,5 ml môi trƣờng nuôi cấy vi rút BSA 2%, Trypsin. Ủ 370C/7 ngày (5). Quan sát sự huỷ hoại tế bào (CPE) qua kính hiển vi lộn ngƣợc hàng ngày. Khuếch đại và lựa chọn chủng vi rút
1.Các chủng vi rút thu hoạch đƣợc tiến hành khuếch đại trên chai tế bào MDCK 75 cm3 mọc đẹp 1 lớp.
2.Lựa chọn các chai tế bào có hủy hoại xuất hiện CPE từ 72 đến 96 giờ sau khi gây nhiễm.
3.Kiểm tra hiệu giá bằng phản ứng ngƣng kết hồng cầu gà hoặc chuột lang (HA) có sử dụng các kháng huyết thanh chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới. 4.Thu hoạch và cất giữ tại -800C các chủng vi rút có hiệu giá HA ≥ 8 phục vụ
cho nghiên cứu.
5.Lựa chọn 75 chủng vi rút cúm phân lập đƣợc năm 2009 - 2010 đại diện cho 3 khu vực miền Bắc – Trung – Tây Nguyên lƣu hành ở các thời điểm khác nhau để tiến hành giải trình tự chuỗi nucleotide.
2.2.5.2 Giải trình tự chuỗi nucleotide các phân đoạn gen HA, NA, M, NS, PB1 và PB2.
Sinh phẩm sử dụng bộ sinh phẩm tách chiết ARN: QIAamp viral RNA Mini Kit, 250 preps, catalog 52904, Qiagen
Tạo đoạn DNA bổ sung
- Mồi Universal 12 (Invitrogen)
- Enzyme Superscript III reverse transcriptase – Invitrogen (Mã catalog 18080085).
Sinh phẩm cho PCR
- PCR kit: + Qiagen HotStar Hifidelity (Mã catalog 202602) + Qiagen One step RT-PCR (Mã catalog 210212)
- Hệ thống mồi sử dụng giải trình chuỗi nucleotide 6 gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 (Xem phụ lục)
Sinh phẩm tinh sạch sản phẩm PCR
- Kit làm tinh sạch sản phẩm PCR (khi sản phẩm PCR thu đƣợc một băng đặc hiệu) của hãng Qiagen: Purification kit Qiaquick (250) Mã catalog 28106
- Kit làm tinh sạch sản phẩm PCR (khi sản phẩm PCR thu đƣợc một gồm nhiều băng không đặc hiệu, trong số đó có băng là sản phẩm mong muốn) của hãng Qiagen: Qiaquick Gel Extraction kit (250) Mã catalog 28706
- Kit làm tinh sạch sản phẩm sau khi chạy chu trình nhiệt gắn dideoxynucleotide của hãng Qiagen: DyeEx 2.0 Spin kit Qiagen Mã catalog 63206
* Giải trình tự gen
- Kit BigDye Terminator v3.1 ABI. Mã catalog 4336917
- Polymer: POP 7 ABI. Mã catalog 4352759
Phƣơng pháp giải trình tự gen.
Sử dụng phƣơng pháp giải trinh tự gen truyền thống (Sanger) với máy giải trình tự nucleotide ABI 3130.
Hình 2.1 Quy trình giải trình tự gen
Tách chiết ARN: Sử dụng bộ sinh phẩm của hãng QIAgen (CHLB Đức) để tách chiết ARN của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 có hiệu giá HA ≥ 8.
1. Trộn đều 140 l mẫu thử (dịch mũi họng, dịch súc họng, dịch nổi nuôi tế bào…) với 560 l đệm AVL. Để 10 phút.
2. Thêm 560 l ethanol (100%) vào hỗn dịch trên, trộn đều.
3. Đặt cột QIAamp spin vào ống ly tâm 2ml sạch. Tách 630 l hỗn dịch vào cột QIAamp spin. Ly tâm 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ ống ly tâm. Lặp lại (3).
4. Đặt cột QIAamp spin vào ống ly tâm sạch, rửa cột QIAamp spin bằng 500
l đệm AW1, ly tâm 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ ống ly tâm.
5. Tiếp tục rửa cột QIAamp spin bằng 500 l đệm AW2, ly tâm 14000 vòng/phút/ 3 phút. Loại bỏ ống ly tâm.
6. Đặt cột QIAamp spin vào ống ly tâm sạch. Cho 60 l nƣớc cất tinh khiết, ủ 2 phút, ly tâm 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ cột QIAamp spin. Phần dung dịch thu đƣợc trong ống ly tâm chính là ARN của vi rút.
Tổng hợp sợi ADN bổ trợ (cDNA)
Tạo hỗn hợp 1 Tạo hỗn hợp 2 Thành phần Mồi Uni12 dNTP ARN 1 phản ứng (l) 5 1 10 Thành phần Đệm x5 DTT RNase inhibitor SuperscriptIII RT enzyme 1 phản ứng (l) 5 1 1 1 Ủ 650
C/ 5 phút. Giữ lạnh ngay Giữ lạnh
Trộn hỗn hợp 1 và hỗn hợp 2, ủ nhiệt độ 43oC/45 phút, 70oC/15 phút, sau đó lƣu giữ tại -20o
C, làm mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại các phân đoạn gen HA, NA, M, PB1, PB2 và NS.
Khuếch đại các phân đoạn gen:
Các phân đoạn gen nghiên cứu đƣợc khuếch đại theo thƣờng quy của Trung tâm Cúm quốc gia, Viện VSDTTW.
- Thành phần hỗn hợp phản ứng PCR Sinh phẩm 1 phản ứng Đệm 10x 10 µl Mồi xuôi (100 nM) 0.5 µl Mồi ngƣợc (100 nM) 0.5 µl HotStar Taq 2 µl Nƣớc tinh sạch 29 µl cDNA 8 µl Tổng 50 µl
Mồi: Sử dụng hệ thống mồi để giải trình tự gen HA, NA, M, NS, PB1 và PB2.
- Chu kỳ nhiệt
Gen Chu kỳ nhiệt
HA, PB1, PB2 94 0 C 2:00 940C 0:20 500C 0:30 720C 1:00 720C 7:00 40C ∞ x 29 chu kỳ NA, NS, M 95 0 C 5:00 940C 1:00 520C 1:00 720C 3:00 720C 7:00 40C ∞ x40 chu kỳ * Điện di sản phẩm PCR: trên thạch 1%, sử dụng thang trọng lƣợng phân tử 1kb.
Tinh sạch sản phẩm PCR
Mục đích: Loại bỏ những sinh phẩm và mồi thừa, sẽ gây nhiễu trong quá trình giải trình tự.
Nếu sản phẩm PCR sau khi điện di cho kết quả đặc hiệu:
Thành phần Cột Qiaquick 250 chiếc
Đệm PB 150 ml
Đệm PE 55 ml
Đệm EB 15 ml
Týp 2 ml 250 chiếc
Chú ý: Thêm 220 ml cồn tuyệt đối (96-100%) vào đệm PE trƣớc khi sử dụng Các bƣớc tiến hành
1.Trộn 5 thể tích đệm PB vào 1 thể tích sản phẩm PCR đã có. 2.Đặt cột Qiaquick vào tube thu 2 ml.
3.Dùng pipet cho sản phẩm đã trộn vào cột Qiaquick, ly tâm 13.000 vòng/30- 60 giây.
4.Loại bỏ nƣớc ở tube thu, đặt lại cột Qiaquick vào tube.
5.Dùng pipet cho 750 l đệm PE vào cột Qiaquick để rửa ADN, ly tâm 13.000 vòng/30-60 giây.
6.Loại bỏ nƣớc ở tube thu, đặt lại cột Qiaquick vào tube, ly tâm 13.000 vòng/60 giây.
7.Chuyển cột Qiaquick sang tube sạch 1.5ml.
8.Cho 30 l đệm EB hoặc nƣớc tinh sạch vào chính giữa màng lọc của cột Qiaquick để tách lấy ADN, ủ tại nhiệt độ phòng trong 1 phút, ly tâm 13.000 vòng/60 giây. ADN tinh sạch giữ ở -20oC đến -80o
C
- Nếu sản phẩm PCR sau khi điện di cho nhiều băng, trong đó có băng sản phẩm cần giải trình tự gen: sử dụng bộ sinh phẩm Gel Extraction kit QIAEX II (catalog 20051)
Thành phần: Đệm QX1 100 ml
Đệm PE 20 ml
QIAEX II 1 ml
Chú ý: Thêm 80 ml cồn tuyệt đối (96-100%) vào đệm PE trƣớc khi sử dụng. Chuẩn bị máy ủ nhiệt hoặc nồi cách thủy 50oC
Các bƣớc tiến hành
1.Cắt băng ADN đặc hiệu trên thạch. Cho thạch vào tube 1.5ml.
2.Xác định trọng lƣợng của miếng thạch. Trộn 3 thể tích đệm QX1 với 1 thể tích miếng thạch chứa DNA có độ dài từ 100bp - 4kb (VD: 300 ul QX1 với 100 mg thạch)
3.Cho QIAEX II theo bảng sau:
Nồng độ DNA (ug) Thể tích QIAEX II (l)
< 2 10
2-10 30
thêm 10 ug thêm 30 l
Lắc bằng máy khoảng 30 giây. 4.Ủ 50o
C trong 10 phút hoà tan thạch, giữ lại DNA. Lắc tube mỗi 2 phút với ADN < 10 kb. Trƣớc khi lấy tube, kiểm tra dung dịch có màu vàng hay không.
5.Ly tâm 13.000 vòng/30 giây, nhẹ nhàng loại bỏ nƣớc nổi bằng pipet.
6.Cho 500 ul đệm QX1 để rửa cặn (chú ý lắc tan cặn khi rửa), ly tâm 13.000 vòng/30 giây
7.Rửa cặn 2 lần với 500 l đệm PE (chú ý lắc tan cặn khi rửa), ly tâm 13.000 vòng/30 giây
8.Để khô trong 10-15 phút cho tới khi cặn có màu trắng.
9. Cho 20 l nƣớc tinh sạch vào tube, lắc cho tan cặn, ủ theo bảng dƣới đây:
Độ dài ADN (kb) Nhiệt độ/ thời gian ủ
< 4 Nhiệt độ phòng/ 5 phút
4-10 50oC/ 5 phút
> 10 50oC/ 10 phút
10. Ly tâm 13.000 vòng/30 giây, cẩn thận và nhẹ nhàng dùng pipet hút nƣớc nổi có chứa ADN tinh sạch sang tube sạch. ADN tinh sạch giữ ở -200C đến -800
Chu trình nhiệt tạo đoạn ADN gắn các dideoxynucleotide (Cycle Sequencing).
Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng
Sinh phẩm Thể tích
Terminator Ready Reaction Mix 8 µl
Mẫu Tuỳ theo chất lƣợng mà lấy thể
tích khác nhau Mồi (3,2 pmol) xuôi hoặc ngƣợc 1 µl
Nƣớc tinh sạch X µl
Tổng 20 µl
* Xác định hàm lƣợng DNA trong mẫu * Lƣợng DNA đƣợc tính theo bảng theo thang DNA chuẩn sau:
Hình 2.2 Thang trọng lƣợng phân tử chuẩn 1 kb- Invitrogen
Chu trình nhiệt
Nhiệt độ Thời gian (phút:giây) Chu kỳ
96oC 1:00 1
96 oC 0:10
25
50 oC 0:05
60 oC 4:00
4 oC Giữ cho tới bƣớc tinh sạch tiếp theo
Kích thƣớc mẫu (bp) Trọng lƣợng (ng) 100-200 200-500 500-1000 >1000 1-3 3-10 10-40 20-50
Sinh phẩm đƣợc trộn trong từng tube 0.2 ul riêng rẽ, ly tâm ngắn trƣớc khi cho vào máy.
Tinh sạch sản phẩm sau khi chạy chu trình nhiệt gắn dideoxynucleotide
Mục đích: Loại bỏ những dideoxynucleotide và sinh phẩm dƣ thừa, tránh nhiễu trong quá trình giải trình tự phân đoạn gen.
Các bƣớc tiến hành
- Lắc nhẹ nhàng cột DyeEx 2.0 Spin, nới lỏng nắp cột.
- Loại bỏ phần dƣới cột DyeEx 2.0 Spin, đặt cột vào týp 2 ml.
- Ly tâm 8000 vòng /2- 3 phút.
- Chuyển cột DyeEx 2.0 Spin sang týp 1.5 ml sạch.
- Dùng pipet cho toàn bộ sản phẩm vào cột gel.
- Ly tâm 8000 vòng /1 phút.
- Loại bỏ cột DyeEx 2.0 Spin
- Làm khô và chuẩn bị đƣa vào máy giải trình tự gen. Trong trƣờng hợp không đƣa vào máy ngay, có thể giữ mẫu đã làm khô ở -20o
C không quá 24h.
Điện di qua mao quản và đọc trình tự chuỗi nucleotide bằng đầu đọc laser
Chuẩn bị mẫu điện di
- Cho 10 µl HiDi Formamide vào tube 1,5 ml chứa DNA sau khi tinh sạch ở bƣớc 2 (khi cho vào trộn nhẹ nhàng bằng pipet)
Chuyển mẫu vào máy:
- Chuyển toàn bộ sản phẩm sang đĩa 96 giếng (dành riêng cho máy ABI 3130)
- Ủ tại 96oC/5 phút. Sau đó chuyển ngay vào giá giữ lạnh. Chuyển đĩa 96 giếng vào máy giải trình tự ABI 3130.
Phân tích kết quả giải trình tự chuỗi nucleotide .
Sử dụng phần mềm DNA star v.8.0 để sắp xếp và thu thập phân đoạn gen HA, NA, M, NS, PB1 và PB2.
Sử dụng phần mềm DNA star v.8.0 – CLUSTAL X để dịch mã, so sánh sự khác biệt axit amin của protein HA, NA, M, NS, PB1 và PB2.
Sử dụng phần mềm MEGA 5 để tạo cây gia hệ HA, NA, M, NS, PB1 và PB2 bằng phƣơng pháp Maximum likehood.
Sử dụng phần mềm Bioedit 7.2.3 xác định độ tƣơng đồng trình tự nucleotide của các phân đoạn gen HA, NA, M, NS, PB1 và PB2.
Phương pháp xác định mức độ kháng oseltamivir của vi rút cúm A(H1N1)pdm09.
Phƣơng pháp xác định mức độ nhạy cảm với oseltamivir bao gồm 2 bƣớc: xác định mức độ hoạt động của enzyme neuraminidase và xác định độ nhạy cảm của vi rút cúm với oseltamivir bằng phản ứng ức chế enzyme neuraminidase (NA). Phƣơng pháp này dựa trên nguyên lý hoạt động của NA. Dƣới tác dụng của NA, axit sialic phân tách với nhóm đƣờng liền giải phóng vi rút cúm khỏi bề mặt tế bào cảm nhiễm. Do vậy, ức chế sự phân tách này sẽ cản trở quá trình giải phóng vi rút cúm, ngăn chặn sự phát tán của vi rút trong cơ thể. MUNANA (2-(4-Methylumbelliferyl)-α-D-N-acetylneuraminic acid sodium salt hydrate) là chất nền huỳnh quang đƣợc sử dụng trong thử nghiệm xác định mức độ nhạy cảm với oseltamivir và mức độ hoạt động của enzyme