cúm A(H1N1)pdm09.
Phân tích cây gia hệ đƣợc tiến hành trên 6 phân đoạn gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 (hình 3.3 - hình 3.9) trong nghiên cứu cho thấy các vi rút lƣu hành tại Việt Nam thƣờng tập trung thành nhóm theo năm: phân nhóm 6A; 6C của cây gia hệ HA là các vi rút lƣu hành năm 2013 (hình 3.3); nhóm 3 cây gia hệ NA hoặc nhóm 2 cây gia hệ M, NS đƣợc tập trung các vi rút lƣu hành năm 2009 - 2010 (hình 3.4; hình 3.6; hình 3.7)…. Kết quả trên cho thấy sự tƣơng đồng về di truyền theo thời gian trong sự tiến hóa của vi rút cúm A(H1N1)pdm09. Trong 6 cây gia hệ đƣợc phân tích, sự phân tách thành nhiều nhóm đƣợc quan sát tại cây gia hệ HA và NA (9 nhóm/phân nhóm), trong khi các cây gia hệ khác chỉ phân tách thành 5-6 nhóm/phân nhóm (M, NS, PB1 và PB2).
Kết quả trên cho thấy sự tiến hóa của các phân đoạn gen trong hệ gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 không đồng đều, sự tiến hóa nhanh hơn của phân đoạn gen HA và NA có thể giải thích do 2 phân đoạn gen này đƣợc biểu hiện với chức năng kháng nguyên bề mặt của vi rút cúm. Vì vậy sẽ chịu tƣơng tác nhiều từ kháng thể kháng vi rút cúm tồn lƣu từ các vật chủ và sự thay đổi
nucleotide trong phân đoạn gen trong quá trình nhân lên trong vật chủ là kết quả của quá trình gây nhiễm.
Sự lƣu hành của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trên toàn cầu, kể từ khi xuất hiện (3/2009) đến hiện tại đã đƣợc ghi nhận có sự tiến hóa nhanh thành 7 nhóm chính (từ nhóm 1 đến 7) qua phân tích gia hệ toàn hệ gen HA [8]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy, sự tiến hóa và tách nhóm/phân nhóm của gen HA và NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam cũng tƣơng đồng với sự tiến hóa của vi rút này trên thế giới. Theo dõi tại Trung tâm kiểm soát và phòng chống bệnh châu Âu (ECDC) cho thấy: trong thời gian lƣu hành 2009-2013, gen HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đã phân tách thành 7 nhóm từ vi rút gốc A/California/07/09 và các vi rút lƣu hành trong năm 2013 tại châu Âu tập trung trong nhóm 6 và 7, các thông báo khác tại Tunisia và Đài Loan cũng cho kết quả tƣơng tự [26], [35], [36]. Nhƣ vậy vi rút A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam có sự tƣơng đồng về gen HA không chỉ với các vi rút lƣu hành tại các nƣớc láng giềng: Thái Lan, Trung Quốc… mà còn tƣơng đồng với các vi rút lƣu hành trên thế giới trong cùng thời gian.
Tƣơng tự, các cây gia hệ M, NS, PB1 và PB2 đều thể hiện sự tƣơng đồng cao về trình tự chuỗi nucleotide của các vi rút A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam và các nƣớc láng giềng và trên thế giới trong thời gian nghiên cứu. Ngoài ra, sự tƣơng đồng cao giữa các vi rút lƣu hành trong năm 2009- 2010 hoặc 2013 đƣợc ghi nhận rõ nét khi những vi rút này tập trung vào một nhóm: nhóm 2 là vi rút lƣu hành 2009-2010; nhóm 6 là các vi rút lƣu hành năm 2013. Kết quả quan sát đƣợc trên tất cả các cây gia hệ M, NS, PB1 và PB2 trong nghiên cứu khẳng định chƣa xuất hiện sự trao đổi và tích hợp của các phân đoạn gen này trong quá trình lƣu hành tại Việt Nam, cho thấy sự ổn
định về di truyền học của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 từ khi xuất hiện đến hiện tại.
Đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam đƣợc thực hiện chủ động, toàn diện trong khuôn khổ hệ thống giám sát cúm quốc gia. Tuy phạm vi phân tích mới chỉ tập trung đƣợc tại khu vực Bắc, Trung và Tây nguyên của Việt Nam, nhƣng thông tin về sự tiến hóa di truyền của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu cũng cho phép nhận định chung cho toàn Việt Nam khi các vi rút sử dụng trong nghiên cứu có độ tƣơng đồng di truyền cao với các nƣớc láng giềng và trên toàn cầu (hình 3.2 đến hình 3.9).
Các phƣơng pháp tiến hành và phần mềm phân tích số liệu trong nghiên cứu đều đảm bảo cập nhật và tiêu chuẩn và đƣợc áp dụng hợp lý nên đảm bảo tính chính xác, độ tin cậy của kết quả nghiên cứu. Chúng tôi sử dụng thuật toán Maximum likelihood trong xây dựng cây gia hệ các phân đoạn gen trong nghiên cứu để có thể xác định xác suất tạo ra cây (tree) hoặc chiều dài của nhánh (branch lengths) để có thể đƣa ra một mô hình cụ thể của quá trình tiến hóa phân tử trên cơ sở các dữ liệu trình tự thu thập đƣợc.
Chúng tôi phân tích 6 cây gia hệ của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu đều sử dụng vi rút vắc xin A/California/07/09 làm gốc và các nhóm trên cây đƣợc hình thành trên cơ sở giá trị boostrap >70 với sự lặp lại của boostrap là 1000. Kết quả của chúng tôi cho thấy trên 3 cây gia hệ NA, M và NS, các vi rút A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam, 2009-2013 bắt đầu xuất hiện trong nhóm 2, trong khi các cây gia hệ HA, PB1 và PB2 xuất hiện các vi rút lƣu hành tại Việt Nam trong nhóm 1 cùng nhóm với vi rút vắc xin. Thêm vào đó, các phân đoạn gen của một vi rút đơn lẻ cũng không thể hiện sự tƣơng đồng khi phân đoạn gen HA có thể trong nhóm 6C trong khi phân đoạn gen NA lại nằm trong nhóm 6B (bảng 3.15) có thể gợi ý sự tiến hoá không đồng đều giữa các phân đoạn gen của một vi rút A(H1N1)pdm09.
Do cỡ mẫu phân tích thực tế trong một năm nghiên cứu không nhiều, dao động từ 4 chủng vi rút năm 2011 đến 31 chủng vi rút năm 2013 nên phân tích sự tiến hoá trong từng năm thông qua phân tích cây gia hệ không thể thực hiện đƣợc, tuy nhiên tổng thể của 75 chủng vi rút trong giai đoạn nghiên cứu cũng đủ thông tin về sự tiến triển của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại một quốc gia và có góp phần hoàn thiện hệ thống giám sát cúm toàn cầu khi Trung tâm cúm Quốc gia của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng là thành viên của hệ thống giám sát.
4.5.Kết quả phân tích protein HA, NA, M1, M2 , NS1, NS2, PB1 và PB2 của vi rút cúm A(H1N1)pdm09.
4.5.1. Protein HA
Protein HA và NA là các kháng nguyên bề mặt của vi rút cúm có chức năng quyết định các hoạt động lây nhiễm của vi rút cúm A tới vật chủ cũng nhƣ kích hoạt cơ chế miễn dịch bảo vệ của cơ thể khi bị nhiễm vi rút cúm. Protein HA đã đƣợc ghi nhận liên quan đến hoạt động dính bám vào thụ cảm thể trong quá trình tiếp cận với tế bào chủ, quyết định độc lực của vi rút cúm gia cầm hoặc ảnh hƣởng tới sự tiến triển nặng của bệnh cúm trên ngƣời. Kháng thể tạo ra từ protein HA (kháng nguyên HA) có tầm quan trọng trong cơ chế miễn dịch bảo vệ cơ thể. Sự có mặt của kháng thể này làm bất hoạt kháng nguyên HA, đồng nghĩa với việc trung hòa vi rút làm cho vi rút không còn khả năng bám vào niêm mạc đƣờng hô hấp, do đó mất khả năng gây bệnh. Sự thay đổi các axit amin trong protetin HA (đột biến) trong quá trình tiến triển của vi rút cúm A sẽ ảnh hƣởng tới các hoạt động chức năng của vi rút cúm [71], [126], [98], [105], [106]. Kết quả phân tích protein HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy sự thay đổi axit amin liên quan đến sự hình thành các nhóm (hình 3.2; bảng 3.3) khi sử dụng vi rút A/California/07/09 làm gốc cây gia hệ. Các nhóm hình thành
trong cây gia hệ ngoài sự tƣơng đồng cao về nucleotide còn có sự tƣơng đồng về thay đổi một số axit amin so với vi rút gốc và các axit amin này đƣợc coi là axit amin chỉ điểm của nhóm/phân nhóm trong cây gia hệ (bảng 3.4). Ví dụ:
- Nhóm 1: P83S, I321V
- Nhóm 2: P83S, S203T, I321V
- Nhóm 3: P83S, S84N,S203T,I116M,I321V…
Nhƣ vậy S203T có thể gợi ý là axit amin chỉ điểm cho các vi rút thuộc nhóm 2 hoặc S84N, I116M là axit amin chỉ điểm cho các vi rút A(H1N1)pdm09 thuộc nhóm 3. Các dấu hiệu chỉ điểm này sẽ giúp cho các nghiên cứu tiếp theo dịch tễ học phân tử của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam, phân nhóm và định dạng đƣợc cấu trúc gia hệ phân đoạn gen HA một cách nhanh chóng.
Tần suất về sự thay đổi axit amin trong protein HA của 75 chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 cũng có sự khác nhau, một số thay đổi đƣợc ghi nhận trong toàn bộ vi rút nghiên cứu P83S và I321V (100%). Đột biến S203T đƣợc xác định trong hầu hết các nhóm/phân nhóm từ 2-7, với tần suất 87,5% (7/8 nhóm/phân nhóm), các thay đổi R223Q, E374K cũng xuất hiện với tần suất đạt 50% (4/8 nhóm/phân nhóm) và D97N, S451N đƣợc xác định 37,5% (3/8 nhóm/phân nhóm), trong khi một số axit amin thay đổi (đột biến) khác xuất hiện đơn lẻ tại 1-2 nhóm/phân nhóm vi rút (bảng 3.4). Kết quả trên cho thấy một số đột biến đƣợc duy trì trong quá trình nhân lên và tái tạo các thế hệ vi rút A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam trong các năm tiếp theo (ví dụ: P83S và I321V) và cũng tƣơng đồng với sự thay đổi của các chủng A(H1N1)pdm09 trong khu vực và trên thế giới. Ngoài ra đột biến có thể sẽ làm thay đổi kiểu hình (chức năng) của vi rút nhƣ G155E, N156K, D222N đã xuất hiện trên các chủng cúm trong nghiên cứu.
Protein HA của vi rút cúm thực hiện các hoạt động chức năng thông qua 5 khu vực kháng nguyên miễn dịch chính: Sa, Sb, Ca1, Ca2 và Cb, có vai trò trong đáp ứng miễn dịch của vật chủ, khởi động sự sản xuất kháng thể bảo vệ kháng vi rút cúm. Sự thay đổi (đột biến) tại các khu vực kháng nguyên hoặc trên bề mặt protein HA có thể gây ảnh hƣởng quan trọng tới sự nhận dạng kháng thể, cho phép vi rút trốn khỏi ảnh hƣởng của đáp ứng miễn dịch [8], [22], [95]. Tuy nhiên, hiện tại vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc phân chia thành nhiều nhóm gen nhƣng đều có biểu hiện một số thay đổi axit amin trên protein HA tại các khu vực kháng nguyên Sa (N125D, K163T và S162H), Sb (S185T và A186T), Ca1 (S203T và R205K) và Ca2 (A141S), những thay đổi này không tạo sự thay đổi về đặc tính kháng nguyên của vi rút so với vi rút gốc (vắc xin) A/California/07/09 trong phản ứng HI khi sử dụng kháng huyết thanh chồn sƣơng [118], [124]. Trong kết quả nghiên cứu này, các thay đổi axit amin trên protein HA có tần suất xuất hiện cao (50% - 100%) đƣợc ghi nhận trong các vi rút cúm A(H1N1)pdm09 là P83S, I321V, S203T, D97N, R223Q và E374K (bảng 3.4), các thay đổi nằm ngoài khu vực kháng nguyên (trừ S203T), vì vậy không ảnh hƣởng tới khả năng tạo đáp ứng miễn dịch với vật chủ.
Trong nghiên cứu, chúng tôi phát hiện sự thay đổi tại vị trí 155, 156 trên protein HA (G155E, N156K) trên 04 vi rút phân lập năm 2013 và 01 vi rút phân lập năm 2011 khi phân tích trình tự axit amin protein HA của 75 chủng vi rút. Các đột biến này nằm giữa các axit amin trong khu vực kháng nguyên Sa (N125D, K163T và S162H), tuy không gây sự thay đổi về đặc tính kháng nguyên của vi rút mang đột biến nhƣng theo các tài liệu của Mỹ, Nhật những thay đổi này có thể làm giảm làm giảm khả năng tƣơng tác với kháng huyết thanh chồn sƣơng trong phản ứng HI (HI = 320) thấp hơn 4 bậc khi so sánh với vi rút gốc A/California/07/09 (bảng 3.9) [23], [36], [47]. Ngoài ra, đột
biến tại vị trí D222N trên protein HA cũng đƣợc phát hiện một chủng vi rút phân lập năm 2013, đột biến này liên quan đến sự tăng tiến triển nặng của bệnh nhân nhiễm cúm A(H1N1)pdm09 [8], [11]. Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 cũng giống các vi rút cúm mùa A/H3N2 hoặc B thông thƣờng gây bệnh nhẹ tại đƣờng hô hấp trên và đƣợc xác định “xu hƣớng” gắn vào thụ cảm thể tế bào chủ thông qua cầu axit sialic gắn liên kết với galactose bởi liên kết α2,6 (SAα2,6) có nhiều trong tế bào biểu mô đƣờng hô hấp trên, trong khi phần lớn vi rút cúm gia cầm có “xu hƣớng” gắn bám theo kiểu SAα2,3 và thụ cảm thể của tế bào đƣờng hô hấp dƣới tƣơng thích với kiểu gắn bám này.
Độc lực của vi rút cúm phụ thuộc vào khả năng gây bệnh thông qua các protein vi rút và đáp ứng miễn dịch của vật chủ bao gồm cả miễn dịch bẩm sinh, miễn dịch thu đƣợc trong quá trình sống. Trong một số nghiên cứu đặc biệt là nghiên cứu trên vi rút cúm gia cầm A/H5N1, A/H7N9..., độc lực của vi rút đƣợc xác định bởi một số các axit amin dƣ tại khu vực phân tách protein HA1 và HA2 hoặc một số axit amin đặc biệt tại protein PB2, NS1.... Tuy nhiên không giống các vi rút cúm gia cầm, vi rút cúm A(H1N1)pdm09 chƣa đƣợc ghi nhận các “dấu ấn” cụ thể liên quan đến độc lực của vi rút. Với vi rút cúm ngƣời, vị trí biểu hiện độ đặc hiệu và ái tính của protein HA (Receptor binding site –RBS) với thụ cảm thể vật chủ là một trong những yếu tố quyết định sự tiếp nhận và lan truyền của vi rút cúm, có thể đánh giá là biểu hiện độc lực của vi rút.
Sự thay đổi axit amin tại vị trí gắn thụ cảm thể của vi rút cúm là dấu hiệu cảnh báo sự thay đổi tƣơng thích của vi rút cúm và tế bào chủ. Đột biến D222G/N/E trên protein HA đã đƣợc ghi nhận tại Mỹ và Nauy, là “dấu hiệu” độc lực tiềm tàng của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 liên quan đến các biểu hiện nặng trên lâm sàng [8], [11]. Đột biến này đƣợc chứng minh là nguyên nhân của sự giảm ái lực gắn bám của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 với thụ cảm thể
SAα2,6 và tăng khả năng gắn bám với thụ cảm thể SAα2,3. Sự hiện diện của các thụ cảm thể SAα2,3 tại phế nang của phổi có thể giải thích cho tiến triển viêm phổi nặng do vi rút cúm sẽ dễ dàng tiếp cận và nhân lên tại khu vực đƣờng hô hấp dƣới, các biểu hiện lâm sàng đƣợc ghi nhận giống nhƣ các trƣờng hợp nhiễm cúm A/H5N1 từng biết. Các đột biến khác D222E và D222N trên protein HA cũng đƣợc ghi nhận trên vi rút cúm A(H1N1)pdm09 và cũng liên quan đến tiến triển nặng của bệnh nhƣ đột biến D222G, tuy nhiên đột biến D222E không đƣợc ghi nhận là đột biến đặc hiệu liên quan đến tiến triển nặng, khi đột biến này có thể phát hiện trong cả trƣờng hợp biểu hiện nhẹ [12], [69], [72], [73], [87], [104], [105].
Kết quả điều tra hồi cứu bệnh nhân mang vi rút đột biến D222N trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy: bệnh nhân vào viện 24/11/2013 có biểu hiện viêm phổi nặng đã đƣợc điều trị thuốc kháng vi rút oseltamivir và kháng sinh đặc hiệu tại khoa điều trị tích cực, Bệnh viện Bạch Mai - Hà Nội nhƣng bệnh nhân vẫn tiến triển nặng và tử vong sau 7 ngày nhập viện với biểu hiện suy đa tạng. Đây là trƣờng hợp đầu tiên phát hiện đột biến D222N liên quan đến tiến triển nặng và tử vong của bệnh nhân nhiễm cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam, tuy nhiên số tử vong do nhiễm vi rút cúm này ghi nhận không ít (66 trƣờng hợp) từ 7/2009-7/2011. Vì vậy việc giám sát vi rút học cúm A(H1N1)pdm09 đặc biệt các đột biến axit amin tại vị trí D222G/N/E, G155E, N156K là rất cần thiết.
Kết quả giám sát có thể cung cấp các thông tin cảnh báo đến các bác sỹ lâm sàng, giúp định hƣớng phác đồ điều trị hiệu quả và đặc biệt giám sát sự lan truyền của các đột biến nguy hiểm này trong quần thể vi rút cúm A(H1N1)pdm09, từ đó đánh giá nguy cơ tăng độc lực của vi rút và phát triển các biện pháp điều trị, dự phòng hiệu quả.
4.5.2. Protein NA.
Cũng nhƣ protein HA, protein NA cũng là một kháng nguyên bề mặt của vi rút cúm, với bản chất là enzyme có vai trò trong việc làm loãng chất nhầy ở đƣờng hô hấp, nhờ đó làm cho vi rút tiếp xúc với tế bào niêm mạc và xâm nhập vào bên trong tế bào dễ dàng hơn. Hơn nữa, enzyme này còn giúp cho việc phá vỡ liên kết giữa vi rút đƣợc nhân lên và tế bào chủ giải phóng các vi rút ra khỏi tế bào nhiễm. Dựa vào các hoạt động chức năng của protein NA, thuốc kháng vi rút oseltamivir, zanamivir đƣợc phát triển với tác dụng ức chế