Các protein M1, M2, NS1, NS2, PB1 và PB2 đƣợc dịch mã từ các trình tự nucleotide của các phân đoạn gen M, NS, PB1 và PB2 trong nghiên cứu. Tiến hành so sánh với trình tự chuỗi axit amin của vi rút vắc xin A/California/07/09 cho thấy sự tƣơng đồng về axit amin của các protein M1; M2; NS1; NS2; PB1; PB2 đạt từ 99,2% (protein NS1) đến 99,9% (protein M2). Số axit amin thay đổi đƣợc xác định nhiều nhất tại protein PB2 (7 axit amin), tiếp theo là các protein PB1 (5 axit amin), protein NS1(4 axit amin), protein M1(3 axit amin). Các protein M2 và NS2 chỉ xác định có sự thay đổi thƣờng gặp là 1 axit amin (bảng 3.7). Một số thay đổi xuất hiện với tần suất cao: I123V trên protein NS1 (100%), V344M và I354L trên protein PB2 (44,4%) trong khi các thay đổi khác đều duy trì tần suất thấp (bảng 3.8). Sự xuất hiện các thay đổi trong 6 protein mã hóa từ 3 phân đoạn gen M, NS và PB1 thƣờng liên quan đến sự tiến hóa của vi rút cúm trên vật chủ khác nhau và từ các tƣơng tác chức năng của các protein này. Protein M2 gắn liền với hoạt động thâm nhập vào tế bào chủ, lắp ráp và nảy chồi vi rút mới và đƣợc chứng mình là có thể tạo ra đáp ứng miễn dịch chéo giữa các phân týp khác nhau của vi rút cúm A, ngoài ra protein M2 cũng là đích tác động của thuốc kháng vi rút thế hệ đầu tiên – amatadine. Các đột biến trên protein này có liên quan đến kháng amatadine đƣợc ghi nhận là L26F, V27A, A30V, A30T, S31N và G34E. Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 mang đột biến kháng amatadine S31N, ngoài ra một đột biến khác L43T liên quan đến khả năng khóa kênh vận chuyển ion tại vị trí gắn kết của rimantadine, đột biến này có nguồn gốc từ vi rút cúm lợn và đƣợc cấu trúc vào protein M2 của cúm A(H1N1)pdm09 thông qua hiện tƣợng trao đổi và tích hợp (reassortment). Hoàn toàn giống vi rút cúm vắc xin, A(H1N1)pdm09 có các đột biến kháng thuốc S31N và L43T trên protein M2 đƣợc hiện diện trên toàn bộ các vi rút nghiên cứu. Các thay
đổi khác trên protein M1, M2, NS1, NS2, PB1, PB2 so với vi rút vắc xin A/California/07/09 đều không ghi nhận có ảnh hƣởng đến hoạt động kích hoạt đáp ứng miễn dịch (NS1); độc lực của vi rút (PB1-F2); khả năng nhân lên và lây truyền của vi rút (PB2) (bảng 3.8). Với kết quả thu đƣợc từ phân tích protein M1, M2, NS1, NS2, PB1, PB2 của chúng tôi cho phép nhận định ảnh hƣởng của vật chủ (ngƣời) chƣa tác động nhiều đến sự tiến hóa của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong quá trình lƣu hành tại Việt Nam 2009-2013.
4.6. Đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam, 2009-2013. Việt Nam, 2009-2013.
Chúng tôi sử dụng phản ứng ngăn ngƣng kết hồng cầu (HI) và kháng huyết thanh cừu A/California/07/09 (reference anti-sheep A/California/07/09)
để đánh giá đặc tính kháng nguyên của 75 chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu. Với kết quả có 70 chủng vi rút (chiếm 93,3%) có khả năng tƣơng tác tốt với kháng huyết thanh chuẩn có hiệu giá tƣơng đƣơng với vi rút vắc xin A/California/07/09 (HI = 640-1280) cho phép nhận định rằng chƣa có sự thay đổi đặc tính kháng nguyên trong hầu hết các vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam trong giai đoạn 2009-2013. Nhƣ vậy, khả năng bảo vệ của vắc xin cúm mùa vẫn đảm bảo trong phòng nhiễm cúm A(H1N1)pdm09. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu cũng ghi nhận 05 vi rút (6,7%) có khả năng tƣơng tác thấp (HI=320) với kháng huyết thanh chuẩn, kết quả đã ghi nhận sự bắt đầu thay đổi đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam và cũng phù hợp với báo cáo gần đây của TCYYTG và một số nƣớc láng giềng. Kết quả phân tích protein HA của 05 chủng vi rút có tƣơng tác thấp với kháng huyết thanh chuẩn đều cho thấy xuất hiện đột biến axit amin tại vị trí G155E, N156K, kết quả phù hợp với một số nghiên cứu của Austrailia và Singapore [10], [23]. Trên cấu trúc tinh thể protein HA, vị trí 155, 156 không nằm trong khu vực thụ cảm thể, tuy nhiên
thay đổi tại các vị trí này sẽ ảnh hƣởng đến khả năng kết bám, độ đặc hiệu, độ bền vững của HA với tế bào chủ, giả thuyết này đã đƣợc chứng minh qua các thử nghiệm in vitro, in vivo và phân tích qua máy tính [47]. Đặc biệt, đột biến N156K đã làm thay đổi sự đặc hiệu của thụ cảm thể, làm mất khả năng ngƣng kết hồng cầu đa dạng của vi rút cúm hoặc làm tăng tiềm năng ion hóa của protein HA, ảnh hƣởng đến sự tƣơng tác của HA với kháng thể hoặc các gốc carbonhydrate xuất phát từ cấu trúc của thụ cảm thể tế bào chủ. Với lý do đó, các vi rút cúm A(H1N1)pdm09 mang đột biến G155E, N156K sẽ có tƣơng tác kém với kháng huyết thanh chuẩn.
Hình 4.1 Bản đồ đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09
Nguồn: Colin Russell và Derek Smith, Đại học Cambrigde, Anh.
Với tỷ lệ thấp (6,7%) các chủng vi rút có mang đột biến G155E, N156K và có biểu hiện thay đổi đặc tính kháng nguyên ghi nhận đƣợc trong nghiên cứu này và đƣợc báo cáo tại một số nƣớc trên thế giới [47], [95], tính đến thời
điểm hiện tại đặc tính kháng nguyên của cúm A(H1N1)pdm09 vẫn ổn định. Bản đồ đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc phát triển bởi D.Smith trên cơ sở giá trị hiệu giá HI cũng cho thấy, phần lớn các vi rút cúm A(H1N1)pdm09 duy trì đặc tính kháng nguyên tƣơng tự vi rút vắc xin A/California/07/09 và tập trung với mật độ cao. Bên cạnh đó cũng có một nhóm có đặc tính kháng nguyên thay đổi khi hiệu giá HI < 2 bậc pha loãng so với vi rút vắc xin đều có đột biến xung quanh các vị trí từ 153 đến 157 trên protein HA (hình 3.13). Kết quả này đã nhấn mạnh sự tiến triển tƣơng đồng của vi rút A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam và trên thế giới và tƣơng tự với các vỉ rút cúm mùa khác A/H1N1 giai đoạn trƣớc đây hoặc A/H3N2.
Tuy không xác định đƣợc vị trí địa lý nhập/xuất của các vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam, nhƣng kết quả trên cùng với các kết quả phân tích gia hệ trong nghiên cứu cũng khẳng định sự khác biệt của vi rút cúm mùa và vi rút cúm gia cầm A/H5N1 khi đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A/H5N1 dƣờng nhƣ khác biệt giữa các vùng địa lý hoặc giữa các quốc gia. Kết quả giám sát cúm gia cầm năm A/H5N1 tại Việt Nam cho thấy clade 1 chỉ xuất hiện tại miền Nam Việt Nam và Campuchia trong khi miền Bắc Việt Nam và Trung Quốc kháng nguyên của vi rút A/H5N1 đƣợc xác định là clade 2.3.4 hoặc 2.3.2.1 hiện tại [41].
Gần đây, một số nghiên cứu trên chồn sƣơng hoặc gây nhiễm trên tế bào cảm thụ (MDCK-SIAT1) các vi rút mang đột biến N156K kết quả cho thấy đột biến này đƣợc duy trì và lan truyền trong các thế hệ sau, gợi ý khả năng thay đổi đặc tính kháng nguyên của vi rút, giảm hiệu quả bảo vệ vắc xin với vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sẽ xảy ra trong tƣơng lai [47]. Ngoài ra, trong quá trình cấy chuyển trên động vật hoặc tế bào dƣới áp lực của đáp ứng miễn dịch lựa chọn, cũng cho thấy vi rút A(H1N1)pdm09 mang N156K thế hệ mới sẽ rất dễ đƣợc bổ sung thêm các đột biến khác xung quanh (N156K với G155E
hoặc N156K với K153E); hoặc tại khu vực đầu hình cầu của protein HA [95]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, toàn bộ 05 vi rút cúm A(H1N1)pdm09 mang đột biến N156K đều đi kèm đột biến G155E (hình 3.11) và phù hợp với kết quả HI với hiệu giá HI thấp hơn so với vi rút vắc xin A/California/07/09 (bảng 3.9).
Tiếp tục phân tích các vi rút mang đột biến sẽ bổ sung thêm các thông tin để có thể định hƣớng vắc xin trong tƣơng lai và đề xuất các vi rút dự tuyển vắc xin phù hợp cho thành phần vắc xin cúm mùa hàng năm.