1.2.4.1 Cấu trúc phân tử
Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 có cấu trúc di truyền hoàn toàn khác so với các vi rút cúm A đã từng biết. Ngay sau khi xuất hiện và gây dịch tại Mexico và Mỹ vào tháng 4 năm 2009, các vi rút cúm mới A/H1N1 đƣợc thu thập và phân tích. Kết quả khi phân tích bộ gen cho thấy vi rút cúm này có hình thái,
cấu trúc bộ gen hoàn toàn mới gồm có: 6 phân đoạn gen (PB2, PB1, PA, HA, NP và NS) tƣơng tự với vi rút cúm lƣu hành trên lợn năm 1998 tại Bắc Mỹ. Phân đoạn gen NA và M rất giống gen của vi rút cúm lƣu hành trên lợn tại châu Âu-Á (H1N1 và H3N2).
Sự sắp xếp và tích hợp gen của vi rút cúm mới này chƣa từng phát hiện tại châu Mỹ cũng nhƣ trên toàn thế giới trƣớc đây. Thêm vào đó, bộ gen của vi rút cúm lợn đã biết lƣu hành tại khu vực bắc Mỹ năm 1998 đƣợc xác định là trao đổi và tích hợp bậc 3 (triple-reassortment) do nó bao gồm: Các phân đoạn gen có nguồn gốc từ lợn cổ điển: HA, NA, M, NS. Các phân đoạn gen có nguồn gốc từ cúm gia cầm dòng Bắc Mỹ: PB2, PA. Phân đoạn gen cúm ngƣời A/H3N2.
Hình 1.9 Cấu trúc bộ gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 [31].
Nguồn: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19525932
Kết quả phân tích trên cho thấy vi rút A(H1N1)pdm09 là vi rút cúm có trao đổi và tích hợp bậc 4. Sự tham gia của các gen M và NA từ các dòng vi rút cúm lợn Á-Âu đã tạo ra một phân týp vi rút cúm A hoàn toàn mới, thể hiện sự trao đổi giữa các loài và đã đáp ứng đầy đủ về vi rút học trong cơ chế gây đại dịch cúm ở ngƣời. Tuy nhiên vi rút cúm này vẫn có xuất phát điểm là sự tiến hóa của vi rút cúm đại dịch H1N1/1918 [31], [42], [43].
Trong vòng 91 năm kể từ đại dịch 1918, vi rút cúm A/H1N1 luôn luôn lƣu hành trên gia cầm, lợn và ngƣời. Sự lây truyền chéo giữa các loài đã xảy ra và kết quả là xảy ra một số vụ dịch nhỏ, lẻ tẻ. Tuy nhiên sự vắng bóng của vi rút cúm A/H1N1 trên ngƣời năm 1957 cũng đƣợc ghi nhận và có thể lý giải về sự cạnh tranh của vi rút cúm gây đại dịch H2N2. Đến năm 1977, vi rút này lại tái nổi trội và không có sự liên quan đến các vi rút cúm A ở các loài khác. Đến năm 2009, vi rút cúm A/H1N1 mới đã xuất hiện và gây thành đại dịch cúm đầu tiên trong thế kỷ 21 [43], [80].
1.2.4.2 Chuẩn hóa thuật ngữ của vi rút cúm gây đại dịch năm 2009.
Sau hơn 2 năm sau đại dịch cúm 2009, vi rút căn nguyên của đại dịch có rất nhiều tên gọi đƣợc sử dụng. Tên thông dụng đƣợc phổ biến trong truyền thông và phần lớn công chúng là cúm lợn “swine flu”. Sử dụng thuật ngữ đó đã gây ra sự tức giận của nông dân và không đảm bảo sự đặc hiệu, ngoài ra có rất nhiều các vi rút cúm lợn khác đang lƣu hành và luôn có khả năng trở thành vi rút mới gây nguy hiểm tiếp theo. Nếu sử dụng thuật ngữ A/H1N1 đơn giản sẽ không thể phân biệt đƣợc với các vi rút cúm mùa A/H1N1 trƣớc đó. Thuật ngữ cúm A/H1N1 mới “novel H1N1” hoặc A/H1N1/09 cũng không đảm bảo sự rõ ràng hơn khi nói đến vi rút cúm gây đại dịch năm 2009.
Khi TCYTTG thông báo kết thúc đại dịch, vi rút cúm A/H1N1 gây đại dịch năm 2009 đã trở thành một vi rút cúm mùa tiếp tục lƣu hành cùng các vi rút cúm mùa khác (A/H3N2 và B). Tuy nhiên, danh pháp của vi rút này vẫn chƣa đƣợc chuẩn hóa dẫn đến việc sử dụng rất nhiều tên cho cùng một vi rút. Để giảm thiểu sự lẫn lộn trong khoa học, truyền thông và khẳng định sự khác biệt với các vi rút cúm mùa A/H1N1 lƣu hành trƣớc đại dịch cúm A/H1N1 năm 2009, ngày 26/9/2011 hội đồng tƣ vấn kỹ thuật cho thành phần vắc xin Nam bán cầu năm 2012 của TCYTTG đã thống nhất đặt tên cho vi rút cúm này là A(H1N1)pdm09 [65].
1.3.Các phƣơng pháp chẩn đoán và nghiên cứu nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong phòng thí nghiệm.
Ngay sau khi xuất hiện và gây dịch tại Mexico tháng 3/2009, các phƣơng pháp xét nghiệm khẳng định nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đã đƣợc phát triển dựa trên các phƣơng pháp đã đƣợc áp dụng phổ biến nhƣ là RT-PCR, realtime RT-PCR, phản ứng ngăn ngƣng kết hồng cầu, phân lập vi rút, giải trình tự chuỗi nucleotide…
1.3.1. Phân lập vi rút.
Phân lập vi rút đƣợc xác định là “tiêu chuẩn vàng” trong chẩn đoán nhiễm vi rút cúm. Vi rút phân lập trong vụ dịch đƣợc sử dụng để nghiên cứu về các đặc điểm sinh học, đặc điểm di truyền, đặc tính kháng nguyên, thông qua các thông tin đó cho phép dự báo đƣợc sự lƣu hành của vi rút cúm trong giai đoạn tiếp theo và góp phần để lựa chọn thành phần vắc xin cúm hàng năm. Đối vi rút cúm mùa (cúm A/H3N2, A/H1N1, B…) việc phân lập vi rút đƣợc tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn cấp độ 2. Đối với vi rút cúm gia cầm (cúm A/H5N1, H9N2…) là vi rút nguy hiểm mức độ 3 (theo phân loại của TCYTTG) nên việc phân lập vi rút yêu cầu đƣợc tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 3. Hiện nay, có 2 hệ thống phân lập đƣợc TCYTTG khuyến cáo là phân lập trên trứng gà có phôi đạt tiêu chuẩn (Specific Pathogenic Free – SPF) 10-11 ngày tuổi và trên dòng tế bào thận chó thƣờng trực (Mardin- Darby Canine Kidney cells – MDCK).
Nguyên lý: Vi rút cúm có thể hồi phục và khuếch đại trên tế bào cảm nhiễm và trứng gà có phôi, trong điều kiện nuôi cấy phù hợp, vì vậy phải đảm bảo về yêu cầu an toàn sinh học
* Phân lập vi rút trên trứng: Vi rút cúm đƣợc phân lập đầu tiên trên trứng gà năm 1936. Sau khi cấy vi rút vào khoang niệu hoặc khoang ối, trứng đƣợc ủ ở 330
trứng đƣợc kiểm tra hiệu giá bằng thử nghiệm ngƣng kết hồng cầu gà 0,5% hoặc hồng cầu ngựa 1% [20]. Một số vi rút cúm A có thể phân lập trực tiếp bằng việc gây nhiễm vào khoang niệu nhƣng có những chủng vi rút cúm A phải gây nhiễm trên dịch ối sau đó mới thích ứng lên khoang niệu trứng gà. Vi rút cúm A/H5N1 thƣờng gây chết trứng sau 24h hoặc 48h gây nhiễm bệnh phẩm.
* Phân lập trên tế bào cảm thụ MDCK [85]: Vi rút cúm có thể nhân lên trên các dòng tế bào tiên phát nhƣ tế bào thận khỉ, thận chuột đất, thận bê hoặc trên dòng tế bào thƣờng trực nhƣ MDCK, Vero. MDCK là dòng tế bào thích hợp nhất để phân lập vi rút cúm trên ngƣời. Khi phân lập vi rút trên các dòng tế bào thƣờng trực phải bổ sung trypsin (TPCK) – protease ngoại sinh. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng trypsin TPCK có ảnh hƣởng tới sự phân tách phân tử HA thành HA1 và HA2, đóng vai trò quan trọng trong việc xâm nhập của vi rút vào tế bào cảm thụ. Tuy nhiên, đối với các dòng tế bào tiên phát thì protease là yếu tố nội sinh, vì vậy vi rút cúm vẫn có khả năng nhân lên mà không cần phải bổ sung trypsin trong quá trình nuôi cấy.
Ưu điểm: Phân lập và nuôi cấy vi rút cho phép đánh giá đƣợc đặc điểm vi rút học, đặc tính kháng nguyên, khả năng tiềm tàng của sự biến chủng vi rút. Phân lập vi rút cúm trên tế bào là đơn giản, thuận tiện, có khả năng phân lập đƣợc một số lƣợng lớn mẫu bệnh phẩm. Tuy nhiên, tùy theo mục đích nghiên cứu để lựa chọn phƣơng pháp phân lập. Phân lập trên trứng vẫn là lựa chọn tối ƣu cho các nhà sản xuất vắc xin trên thế giới vì nó có khả năng khuếch đại một lƣợng lớn vi rút với hiệu giá cao và vắc xin cúm hiện tại đang đƣợc sản xuất trên trứng gà có phôi [48], [86]. Tuy nhiên, việc sản xuất vắc xin trên tế bào MDCK và Vero cũng đang đƣợc nghiên cứu [13], [64].
Nhược điểm: Tỉ lệ phân lập phụ thuộc nhiều chất lƣợng bệnh phẩm, thời gian lấy mẫu, bảo quản và môi trƣờng nuôi cấy.
Vi rút sau khi phân lập đƣợc định týp (xác định đặc tính kháng nguyên) bằng phản ứng ngăn ngƣng kết hồng cầu
1.3.2. Phương pháp phát hiện vật liệu di truyền
Quy trình xét nghiệm nhiễm vi rút A(H1N1)pdm09 dựa trên xét nghiệm phát hiện vật liệu di truyền bằng phƣơng pháp sinh học phân tử là phản ứng chuỗi polymerase (PCR) hoặc phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực (realtime RT-PCR). Qui trình xét nghiệm này đƣợc áp dụng cho việc xác định cúm B, cúm A và các phân týp cúm A trong mẫu bệnh phẩm hoặc dịch nuôi cấy. Hiện nay, PCR đã trở thành một công cụ đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực của y sinh học. Các quy trình RT- PCR hoặc realtime RT-PCR chẩn đoán nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc phát triển bởi các PTN chuẩn thức của TCYTTG: CDC, Atlanta; NIID, Nhật bản; VIIRL, Australia và đƣợc giới thiệu trong “Hƣớng dẫn chẩn đoán nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm09” của TCYYTG [16].
1.3.2.1 Phản ứng di truyền phân tử (RT-PCR)
Nguyên lý: Phản ứng sao chép ngƣợc chuỗi polymerase RT-PCR (Reverse transcriptase - Polymerase Chain Reaction) đã đƣợc áp dụng và phát triển cho phần lớn các vi rút có vật liệu di truyền là ARN. Phƣơng pháp này có khả năng xác định nhanh sự nhiễm vi rút, thông qua xác định vật liệu di truyền của vi rút bằng khả năng phát hiện đoạn ARN đặc hiệu của vi rút cúm trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng.
Ưu điểm: Là phƣơng pháp nhanh nhạy, có độ đặc hiệu cao và chính xác khi đƣợc kiểm soát tốt.
Nhược điểm: Phƣơng pháp RT-PCR yêu cầu trang thiết bị và sinh phẩm với giá thành tƣơng đối cao và cần kỹ thuật thực hiện thành thạo, hơn nữa, các dụng cụ và nơi thực hiện xét nghiệm phải tách biệt theo từng giai đoạn của phản ứng RT-PCR để tránh nhiễm chéo tạo dƣơng tính giả.
Cho tới nay, RT-PCR vẫn đƣợc coi là phƣơng pháp tối ƣu để phát hiện vi rút cúm, là một trong hai tiêu chuẩn trong chẩn đoán phòng thí nghiệm để khẳng định các trƣờng hợp nhiễm cúm theo qui định của TCYTTG.
Trong trƣờng hợp kết quả của phƣơng pháp RT-PCR không cho kết quả rõ ràng hoặc trong trƣờng hợp cần khẳng định chính xác kết quả, PTN sẽ xét nghiệm bằng phƣơng pháp Realtime RT-PCR.
1.3.2.2 Phương pháp Real time RT-PCR
Nguyên lý: Khác với RT-PCR thông thƣờng, phƣơng pháp này sử dụng một mẫu dò phát huỳnh quang (probe) có khả năng phát hiện sản phẩm PCR đặc hiệu trong quá trình tổng hợp sản phẩm. Real time RT-PCR sử dụng cặp mồi và chất hóa học phát huỳnh quang hoặc probe có đánh dấu huỳnh quang (SYBR Green I, molecular beacon, hybridization probe và Taqman probe) cho phép phát hiện chính xác số bản sao ADN của vi rút từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng theo thời gian thật (real-time) [44], [54], [70]. Phƣơng pháp Real time RT-PCR đƣợc ứng dụng để định lƣợng ADN, ARN, chẩn đoán các vi rút gây bệnh nhƣ vi rút cúm, viêm gan…[37], [38]. Phƣơng pháp Real time RT- PCR không cần điện di sản phẩm nhƣ phƣơng pháp RT-PCR thông thƣờng nên phƣơng pháp Real time RT-PCR đƣợc mô tả nhƣ một hệ thống “đóng”.
Ưu điểm: Phƣơng pháp này rất đặc hiệu và có độ tin cậy cao. Phƣơng pháp nhanh, nhạy, có độ chính xác giảm thiểu nguy cơ tạp nhiễm.
Nhược điểm: Phƣơng pháp Real time RT-PCR yêu cầu trang thiết bị và sinh phẩm với giá thành tƣơng đối cao. Do phƣơng pháp có độ nhạy cao nên cần có kỹ năng thao tác chuẩn xác, tránh nhiễm chéo trong quá trình thực hiện.
Nếu trong trƣờng hợp phƣơng pháp Realtime RT- PCR vẫn cho kết quả không rõ thì mẫu bệnh phẩm này sẽ đƣợc lặp lại từ bƣớc tách chiết mẫu và có thể chạy song song hai phƣơng pháp RT-PCR và Realtime PCR; hoặc PTN có
thể yêu cầu lấy lại bệnh phẩm và xét nghiệm theo thƣờng quy của phòng từ bƣớc nhận bệnh phẩm.
1.3.2.3 Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng phiên mã ngược (RT-LAMP)
Nguyên lý: Phƣơng pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng phiên mã ngƣợc RT-LAMP (Reverse transcriptase - Loop - mediated isothermal amplification) là một phƣơng pháp mới để khuếch đại ADN trong điều kiện đẳng nhiệt, do đó loại bỏ đƣợc sự thay đổi các chu kỳ nhiệt trong phƣơng pháp RT-PCR thông thƣờng. Phản ứng khuếch đại ADN thực hiện tại 630C trong 60 phút và cố định sản phẩm tại 800C trong 2 phút trong hệ thống máy Loopamp-real time LA-200 (Kyoto – Nhật Bản). Vì vậy, thời gian tiến hành phản ứng sẽ đƣợc rút ngắn [78], [83]. Trong một phản ứng đã sử dụng 6 loại mồi bao gồm 2 mồi trong, 2 mồi ngoài và 2 mồi dạng vòng đã làm tăng độ nhạy của phản ứng.
Ưu điểm: Phƣơng pháp này có thể phát hiện vi rút cúm trong giai đoạn sớm của bệnh, đƣợc thực hiện trong khoảng thời gian ngắn (30 phút - 1 giờ) là có thể có kết quả.
Nhược điểm: Độ nhạy và độ đặc hiệu của phƣơng pháp này cần đƣợc đánh giá thông qua một số lƣợng lớn mẫu thu thập ở bệnh nhân nhiễm cúm.
Hiện nay, phƣơng pháp này cũng đang đƣợc phát triển để chẩn đoán nhanh một số bệnh truyền nhiễm khác do vi rút nhƣ vi rút SARS-CoV, vi rút viêm gan B, vi rút viêm não Nhật Bản [99].
1.3.2.4 Phương pháp xác định trình tự gen (Sanger sequence)
Hiện nay, các phƣơng pháp xác định trình tự gen đƣợc thực hiện trên máy phân tích trình tự chuỗi tự động nhƣ ABI PRISM 3100 - Avant, Bechman Counter (Mỹ).
Nguyên lý: Sự xuất hiện của các dideoxynucleotide (các nucleotide mất gốc -OH ở vị trí cacbon 3' và đƣợc thay bằng -H, đã đƣợc đánh dấu huỳnh quang với các màu khác nhau) trong quá trình tổng hợp ADN bổ sung (mẫu gen cần giải trình tự ở dạng ADN sợi đơn) tạo ra những đoạn ADN có độ dài khác nhau. Những đoạn ADN này đƣợc điện di qua mao quản từ nhỏ đến lớn và các dideoxynucleotide đƣợc phát hiện bởi đầu đọc laser. Trình tự gen của mẫu chính là trình tự bổ sung các
dideoxynucleotide đƣợc phát hiện bởi đầu đọc laser.
Phản ứng dựa trên nguyên tắc của phƣơng pháp Sanger có sử dụng các dideoxynucleotide. Mỗi loại dideoxynucleotide đƣợc đánh dấu bằng một chất huỳnh quang có màu khác nhau.
Ưu điểm: Phƣơng pháp xác định trình tự gen xác định đặc điểm di truyền học, xây dựng cây gia hệ trên cơ sở so sánh gen HA, NA và M của vi rút cúm, từ đó xác định tần suất tiến hóa, các đột biến trên một số gen liên quan đến khả năng tăng độc lực của vi rút, giảm độ nhạy của thuốc kháng vi rút cũng
Hình 1.10 Nguyên lý giải trình tự gen
Hình 1
Đoạn ADN lớn
ddTCP ddTTP
ADN sợi đơn
Trình tự của mẫu ban đầu sẽ là
Đoạn ADN nhỏ Trong qua trình điện di, đầu đọc laser sẽ thu đƣợc tín hiệu của các ddNTP Thành phần: DNA polymerase I dATP dGTP dCTP ddATP ddGTP đ đCTP
nhƣ phát hiện các yếu tố tiềm tàng của sự trao đổi và tích hợp của vi rút cúm mới và các chủng vi rút cúm đang lƣu hành.
Nhược điểm: Phƣơng pháp xác định trình tự gen (Sequence) yêu cầu trang thiết bị và sinh phẩm với giá thành rất cao.
Phƣơng pháp giải trình tự nucleotide cũng đƣợc áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu sự tiến hóa của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đã giúp phát hiện sự thay đổi trong cấu trúc di truyền có thể gây ảnh hƣởng tới khả năng gây bệnh của vi rút cúm, quy trình cũng đƣợc TCYTTG hƣớng dẫn [108].
1.3.3. Phương pháp phát hiện kháng thể
Đó là phƣơng pháp phát hiện kháng thể kháng vi rút cúm trong huyết thanh bệnh nhân. Có 3 phƣơng pháp cơ bản đƣợc sử dụng là phản ứng ngăn ngƣng kết hồng cầu (HI), thử nghiệm hấp phụ liên kết enzyme (ELISA) và phản ứng trung hoà vi lƣợng (MN). Kết quả đƣợc xác định dựa vào việc phát hiện kháng thể kháng đặc hiệu vi rút cúm (ELISA, MN) hoặc sự biến động kháng thể (tăng gấp 4 lần) giữa 2 mẫu huyết thanh (HI). Chẩn đoán huyết thanh học chỉ có ý nghĩa hồi cứu và có tác dụng rất hạn chế đối với các trƣờng hợp lâm sàng. Tuy nhiên, nó cũng là cơ sở cho việc chẩn đoán nếu nhƣ việc phát hiện kháng nguyên hoặc vật liệu di truyền của vi rút không đạt kết quả do chất lƣợng bệnh phẩm hoặc một lý do nào khác.
1.3.3.1 Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (Haemagglutin Inhibition - HI)