Chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng tƣơng tác của oseltamivir với vi rút cúm A(H1N1)pdm09 mang đột biến H275Y (A/Vietnam/IS0213167/2013) đƣợc phát hiện trên phân đoạn gen NA trong nghiên cứu. Sử dụng kết quả của Trung tâm cúm Quốc gia – Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng về thử nghiệm ức chế neuraminidase (NAI) ức chế 50% số vi rút cúm bằng oseltamivir cho phép đánh giá khả năng tƣơng tác của vi rút với thuốc kháng vi rút. Thử nghiệm đƣợc thực hiện với các vi rút chứng (có hoặc không có đột biến H275Y), kết quả cho thấy: vi rút mang đột biến H275Y trong nghiên cứu yêu cầu một lƣợng oseltamivir cao hơn 250 lần so với vi rút chứng (không mang H257Y) để ức chế đƣợc 50% hoạt động của oseltamivir. Nhƣ vậy vi rút này đƣợc đánh giá theo TCYTTG là giảm mạnh khả năng tƣơng tác với oseltamivir hoặc có biểu hiện kháng oseltamivir (giảm hiệu quả ức chế vi rút >100 lần) (Bảng 3.12).
Giá trị độ nhạy với oseltamivir của vi rút trong nghiên cứu đƣợc xác định là giảm 250 lần, tuy nhiên một số nghiên cứu giai đoạn trƣớc tại Việt Nam đã phát hiện các vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam có mang H275Y có giá trị giảm độ nhạy dao động từ 356 đến 2944 lần so với giá trị ngƣỡng [53], [68]. Nhƣ vậy tuy cùng xuất hiện đột biến đặc hiệu kháng
oseltamivir (H275Y) nhƣng biểu hiện giảm độ nhạy của các vi rút khác nhau. Biểu hiện sinh học (kiểu hình) là kết quả của cấu trúc di truyền (kiểu gen) và thƣờng bị ảnh hƣởng của nhiều yếu tố khác nhau (môi trƣờng, vật chủ...) sẽ tạo ra sự đa dạng sinh học trong tự nhiên.
Nghiên cứu năm 2010 tại Pháp, về hiện tƣợng kháng oseltamivir của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 mang đột biến đặc hiệu H275Y cho thấy: mức độ kháng oseltamivir sẽ tăng nếu vi rút có thêm đột biến I223R (giảm độ nhạy 6195 lần) và vi rút mang H275Y và I223R cũng sẽ kháng cả zanamivir (giảm độ nhạy 16,5 lần) ở mức độ cao [71]. Ngoài ra, đột biến kép H275Y và S247N cũng làm tăng biểu hiện kháng oseltamivir (giảm độ nhạy 5880 lần) và zanamivir (giảm độ nhạy 5 lần) cũng đƣợc phát hiện tại Austrailia và Singapore, 2009-2010 [56].
Trong nghiên cứu này của chúng tôi, vi rút A(H1N1)pdm09 chỉ mang đột biến duy nhất H275Y liên quan đến kháng oseltamivir, vì vậy mức độ biểu hiện giảm độ nhạy với oseltamivir là 250 lần là phù hợp. Sử dụng oseltamivir nhƣ thuốc đặc trị cho nhiễm vi rút cúm A, đặc biệt là nhiễm cúm A/H5N1 tại Việt Nam đang đƣợc phổ biến rộng rãi, vì vậy khả năng tăng và lan rộng các vi rút có biểu hiện kháng thuốc là có thể trong tƣơng lai. Để kiểm soát đƣợc tình trạng kháng oseltamivir của vi rút cúm việc duy trì, tăng cƣờng giám sát vi rút học sự lƣu hành vi rút cúm tại Việt Nam, đồng thời nâng cao khả năng phát hiện hiện tƣợng kháng thuốc và xây dựng phác đồ điều trị phối hợp thuốc hợp lý sẽ là các phƣơng pháp tích cực cần đƣợc quan tâm.
4.8.Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển cho phát triển vắc xin phòng cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam. A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam.
Vắc xin đƣợc xác định là công cụ hiệu quả nhất trong phòng chống nhiễm vi rút cúm và đƣợc sử dụng rộng rãi trên thế giới từ những năm 1960. Hiện tại, vắc xin cúm lƣu hành thƣơng mại có thành phần gồm 3 loại vi rút
(A/H1N1pdm; A/H3N2 và B-Victoria hoặc B -Yamagata) hoặc 4 loại vi rút (A/H1N1pdm; A/H3N2, B-Victoria và B-Yamagata), các vi rút thành phần của vắc xin đƣợc lựa chọn hàng năm thông qua hệ thống giám sát cúm toàn cầu của TCYTTG. Tại Việt Nam, vắc xin cúm đã đƣợc thử nghiệm phát triển tại một số công ty nhƣ: VABIOTECH (vắc xin cúm A/H5N1 hoặc A(H1N1)pdm09), IVAC (vắc xin cúm A(H1N1)pdm09), POLYVAC.... Với các công nghệ phát triển khác nhau: tế bào thận khỉ tiên phát (VABIOTECH), tế bào MDCK (POLIVAC) hoặc trứng gà có phôi (IVAC), nhƣng đều sử dụng các vi rút vắc xin từ TCYTTG là A/California/07/09. Tuy nhiên, sự lƣu hành của vi rút cúm khác nhau về thời gian, phân týp vi rút cũng nhƣ sự nổi trội của các phân týp khác nhau.... Chính vì vậy, việc tự lựa chọn cho mình vi rút dự tuyển vắc xin và sản xuất vắc xin cúm từ vi rút dự tuyển đó là chiến lƣợc phòng bệnh của một số nƣớc : Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc, Cuba, Nga.... Việc sử dụng vắc xin trong nƣớc sản xuất, sử dụng vi rút lựa chọn từ giám sát vi rút học trong nƣớc sẽ giúp cho hiệu quả phòng bệnh sẽ cao vì phù hợp về thời gian (mùa), tƣơng đồng cao về đặc tính kháng nguyên đảm bảo khả năng đáp ứng miễn dịch tốt.
Để góp phần vào việc phát triển một vắc xin phòng chống cúm A(H1N1)pdm09 có hiệu quả tại Việt Nam, kết quả nghiên cứu của chúng tôi đã giới thiệu 02 vi rút có khả năng sử dụng để phát triển vắc xin:
A/Vietnam/HN36947 và A/Vietnam/NH13284. Hai vi rút này đƣợc lựa chọn theo tiêu chí của TCYTTG áp dụng vào điều kiện Việt Nam là :
Đại diện cho đa phần các chủng lƣu hành tại Việt Nam về di truyền cũng nhƣ đặc tính kháng nguyên.
Có khả năng khuếch đại tốt trên các hệ thống nuôi (tế bào hoặc trứng).
Trong lựa chọn vi rút dự tuyển vắc xin với mục đích đảm bảo tốt nhất khả năng tạo miễn dịch trong quần thể (là vi rút đại diện cho phần lớn các vi rút đang lƣu hành), tạo điều kiện thuận lợi cho các đơn vị sản xuất vắc xin có thể giảm giá thành (do có khả năng khuếch đại tốt), thuận lợi trong quá trình đánh giá chất lƣợng vắc xin (tính ổn định về di truyền và đặc tính kháng nguyên). Hai vi rút đƣợc lựa chọn trong nghiên cứu đều ở phân nhóm 6C của cây gia hệ HA hoặc 6A hoặc 6B của cây gia hệ NA, đây là nhóm tập trung 32% (24/75 vi rút - cây HA) của toàn bộ nghiên cứu và đƣợc phân lập trong năm gần nhất của nghiên cứu 2013 (hình 3.2, hình 3.4; bảng 3.13).
Nhƣ vậy các vi rút đƣợc lựa chọn đảm bảo là vi rút thế hệ mới nhất (phân lập năm 2013) và đảm bảo cho sự tiến triển (tiến hóa) cao về di truyền, vì vậy sẽ có biểu hiện kháng nguyên mới nhất, cập nhật nhất trong thời điểm hiện tại trong quần thể vi rút lƣu hành tại Việt Nam. Kết quả đánh giá khả năng khuếch đại của vi rút cũng cho thấy, 2 vi rút dự tuyển vắc xin đều có khả năng nhân lên và đạt hiệu giá ngƣng kết hồng cầu (HA) cao và ổn định sau 5 lần cấy truyền (bảng 3.14).
Trong nghiên cứu chúng tôi sử dụng tế bào MDCK và thực hiện 5 lần cấy chuyển với mục đích hạn chế các thay đổi (đột biến) trong quá trình nhân lên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 và đảm bảo có hiệu giá khuếch đại tốt nhất. Mỗi loại vi rút cúm có hệ thống nuôi cảm nhiễm khác nhau, các nghiên cứu cho thấy vi rút cúm A(H1N1)pdm09 dễ dàng nhân lên và khuếch đại trên tế bào có nguồn gốc động vật (MDCK, Vero), trong khi vi rút cúm A/H3N2 lại ghi nhận có hiệu quả tốt khi sử dụng trứng gà có phôi [88]. Ngoài ra nghiên cứu tại Nga cho thấy không có sự khác biệt về hiệu quả nhân lên và khuếch đại vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trên tế bào MDCK và NHBE (human bronchial epithelium cell – tế bào biểu mô phế quản ngƣời) đã gợi ý việc sử dụng vi rút dự tuyển vắc xin có nguồn gốc từ tế bào MDCK sẽ có hiệu quả
cao trong phát triển vắc xin cúm giảm độc lực (innactivated vaccine) [58]. Thêm vào đó, việc ổn định đặc điểm di truyền của các vi rút vắc xin là rất quan trọng, vì vậy việc sử dụng dòng tế bào MDCK sẽ hạn chế đƣợc sự thay đổi (đột biến) của vi rút cúm trong quá trình nhân lên và khuếch đại so với sử dụng trứng gà có phôi [88].
Sự ổn định về di truyền và đặc tính kháng nguyên cũng đƣợc đánh giá thông qua kết quả nhân lên của vi rút trong quá trình cấy chuyển 5 lần, kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy 02 chủng vi rút dự tuyển vắc xin lựa chọn đều ổn định về đặc tính kháng nguyên trong quá trình cấy chuyển (hình 3.13). Khi vi rút duy trì ổn định đƣợc khả năng nhân lên trong các lần cấy chuyển, sẽ cho phép xác định liều gây nhiễm cho sản xuất vắc xin đồng thời lƣợng giá đƣợc hàm lƣợng protein HA thu đƣợc trong quá trình sản xuất và kiểm soát DNA tế bào dƣ trong thành phần hỗn hợp vi rút, góp phần phát triển và hoàn thiện quy trình sản xuất vắc xin trên tế bào.
Tổ chức Y tế Thế giới chỉ đề cử 1 chủng vi rút dự tuyển cho mỗi phân týp trong thành phần vắc xin, trong nghiên cứu này, chúng tôi giới thiệu 2 chủng vi rút dự tuyển cho phát triển vắc xin cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam, nhằm tạo điều kiện cho các nhà sản xuất có sự lựa chọn cho các quy trình sản xuất của mình khi việc sử dụng nguyên vật liệu nền, tại các cơ sở sản xuất vắc xin tại Việt Nam khác nhau: sử dụng tế bào thận khỉ tiên phát (VABIOTECH), trứng gà có phôi (IVAC) hoặc tế bào Vero (POLIVAC).... Việc tƣơng thích vi rút vắc xin vào hệ thống nuôi để đạt hiệu quả khuếch đại cao và ổn định cần có một sự so sánh nhất là trong giai đoạn đầu của phát triển vắc xin tại Việt Nam, khi các quy trình sản xuất đang từng bƣớc hoàn thiện.
Sau 4 năm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 xuất hiện và lƣu hành tại Việt Nam cũng nhƣ trên thế giới, các nghiên cứu giám sát sự tiến hóa của vi rút,
phát triển vắc xin và đánh giá ảnh hƣởng của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đã đƣợc thực hiện và có nhiều kết quả có ý nghĩa khoa học. Nghiên cứu của chúng tôi, lần đầu tiên có cơ hội tiến hành một cách hệ thống, theo dõi đƣợc sự tiến triển về di truyền học của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam từ khi xuất hiện đến hiện tại. Tất cả các kết quả thu đƣợc trong nghiên cứu này sẽ có ý nghĩa khoa học lớn hơn khi công tác giám sát vi rút học tiếp tục đƣợc duy trì và mở rộng trong những năm tiếp theo, những thông tin cập nhật của vi rút cúm sẽ góp phần không nhỏ trong công tác phòng chống bệnh và đảm bảo sức khỏe cho cộng đồng Việt Nam.
KẾT LUẬN
1.Đặc điểm di truyền của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam 2009 - 2013.
- Các phân đoạn gen đƣợc phân tách thành nhiều nhóm/phân nhóm khác nhau trên cây gia hệ: 9 nhóm/phân nhóm trên phân đoạn gen HA và NA hoặc 5-6 nhóm/phân nhóm tại các phân đoạn gen M, NS, PB1 và PB2. - Sự tiến hóa của các phân đoạn gen trong nghiên cứu không đồng đều: phân
đoạn gen HA và NA tiến hóa nhanh hơn các phân đoạn khác.
- Các vi rút lƣu hành trong cùng thời gian (năm) tại Việt Nam có sự tƣơng đồng cao về di truyền và cũng tƣơng đồng với các vi rút lƣu hành tại các nƣớc láng giềng hoặc trên thế giới trong giai đoạn nghiên cứu.
- Chƣa phát hiện sự trao đổi và tích hợp giữa các phân đoạn gen nghiên cứu của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 với các vi rút cúm A khác lƣu hành trên ngƣời và động vật.
- Một số đột biến liên quan đến thay đổi kiểu hình đƣợc ghi nhận: làm tăng tiến triển nặng của bệnh (đột biến vị trí D222N), giảm tƣơng tác ngƣng kết hồng cầu (đột biến vị trí G155E, N156K) trên protein HA và giảm độ nhạy với oseltamivir (H275Y) trên protein NA phát hiện trên một số vi rút A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu lƣu hành tại Việt Nam.
2.Đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09
- Phần lớn vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu có đặc tính kháng nguyên tƣơng tự với vi rút vắc xin A/California/07/09 (70 chủng vi rút chiếm 93,3%), 5 chủng vi rút (1 chủng vi rút phân lập năm 2011 và 4 chủng vi rút phân lập năm 2013) có biểu hiện thay đổi đặc tính kháng nguyên (chiếm 6,7%) đều xuất hiện đột biến tại vị trí G155E, N156K trên protein HA, gợi ý giảm hiệu quả bảo vệ vắc xin với vi rút cúm, dịch sẽ xảy ra trong tƣơng lai.
- Các đột biến khác tại vị trí D222N trên protein HA hoặc H275Y trên protein NA đều không ảnh hƣởng đến đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu.
3.Lựa chọn và đề xuất vi rút dự tuyển phát triển vắc xin cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam
Đã lựa chọn 2 chủng vi rút dự tuyển cho phát triển vắc xin cúm tại Việt Nam (A/Vietnam/HN36947 và A/Vietnam/NH13284) đáp ứng đầy đủ 3 tiêu chí của TCYTTG:
− Đại diện cho đa phần các vi rút cúm lƣu hành tại Việt Nam trong thời điểm hiện tại về di truyền và đặc tính kháng nguyên.
− Có khả năng khuếch đại tốt trên hệ thống tế bào nuôi (trên trứng hoặc tế bào MDCK)
KIẾN NGHỊ
Từ những kết quả nghiên cứu trên chúng tôi đƣa ra một số kiến nghị: 1.Tiếp tục duy trì và mở rộng giám sát vi rút học vi rút cúm A(H1N1)pdm09
tại Việt Nam để phát triển các nghiên cứu tiến hóa của vi rút và phát triển vắc xin phòng bệnh cho ngƣời dân Việt Nam.
2.Hoàn thiện phân tích di truyền của 2 phân đoạn gen còn lại NP và PA để thu thập đầy đủ các thông số di truyền học, xác định và kiểm soát sự tiến hóa của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam.
3.Phối hợp với các đơn vị sản xuất vắc xin tại Việt Nam, phát triển quy trình sản xuất vắc xin cúm A(H1N1)pdm09 trong quy mô phòng thí nghiệm.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Hoang Vu Mai Phuong, Nguyen Co Thach, Nguyen Le Khanh Hang,
Nguyen Thi Kim Phuong and Le Quynh Mai (2013), “Oseltamivir resistance among influenza viruses: surveillance in northern Viet Nam, 2009–2012”, Western Pacific Surveillance and Response Journal, 2013, 4(2), pp. 25–29.
2. Nguyễn Thị Kim Phƣơng, Lê Thị Quỳnh Mai (2014), “Vắc xin phòng chống cúm: Lịch sử phát triển công nghệ hiện tại và tƣơng lai”, Tạp chí Y học Dự phòng, 3(151), tr. 9-19
3. Nguyễn Thị Kim Phƣơng, Lê Thị Thanh, Ngô Hƣơng Giang, Nguyễn Vũ Sơn, Phạm Thị Thu Hằng, Hoàng Vũ Mai Phƣơng, Trần Hải Anh (2014), “Lựa chọn chủng vi rút dự tuyển cho phát triển vắc xin cúm A/H1N1pdm09 tại Việt Nam”, Tạp chí Y dược Lâm sàng 108, 9 (3), tr.118 -125.
4. Nguyễn Thị Kim Phƣơng, Trần Hải Anh, Nguyễn Vũ Sơn, Trần Thu Hƣơng, Vƣơng Đức Cƣờng, Phạm Thị Hiền, Ngô Hƣơng Giang, Hoàng Thu Hƣơng, Lê Thị Quỳnh Mai (2014), “ Sự phân tách gen HA của vi rút cúm A/H1N1pdm09 lƣu hành tại Việt Nam, năm 2009 – 2013” , Tạp chí Y học Dự phòng, 8(157), tr. 8-15.
5. Nguyen Le Khanh Hang, Nguyen Thi Kim Phuong, Nguyen Co Thach, Hoang Vu Mai Phuong, Le Thi Thanh, Vuong Duc Cuong, Nguyen Phuong Anh, Tran Thi Thanh Loan, Nguyen Gia Binh, Le Quynh Mai (2015), “Viological characterzation of influenza H1N1pdm09 in Vietnam, 2010 – 2013”, Influenza and Other Respiratory Viruses, has been accepted on April 30, 2015.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Bộ Y tế (2009), Thông báo /TB-DPMT, ngày 25/7/2009 của Bộ Y tế về tình
hình dịch cúm A(H1N1), Bộ Y tế.
2. Bộ Y tế (2009), Thông báo số 470/TB-BYT ngày 31/5/2009 về trường hợp
bệnh nhân cúm A(H1N1) đầu tiên tại Việt Nam, Bộ Y tế.
3. Nguyễn Trần Hiển (2011), Báo cáo tổng hợp kết quả khoa học công nghệ đề
tài Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng và vi rút học cúm A/H1N1/09 đại dịch tại khu vực miền Bắc, Trung và Tây Nguyên 2009 - 2010, đề xuất các giải pháp phòng chống dịch Hà Nội.
4. Nguyễn Trần Hiển (2012), Cúm A/H1N1/09 đại dịch tại Việt Nam, Nhà xuất
bản Y học, tr. 27 - 58.
5. Lê Văn Hiệp (2009), Bệnh cúm và vắc xin, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
6. Lê Thị Oanh (2011), Vi sinh vật Y học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 298-
311.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
7. Ampofo WK, Al Busaidy S, and Cox NJ (2013), "Strengthening the influenza
vaccine virus selection and development process: outcome of the 2nd WHO Informal Consultation for Improving Influenza Vaccine Virus Selection held at the Centre International de Conférences (CICG) Geneva, Switzerland, 7 to 9 December 2011",Vaccine, 31(32), pp. 3209-21.
8. Antón A, Pozo F, Niubó J, Casas I, and Pumarola T (2012), "Influenza A(H1N1)pdm09 virus: viral characteristics and genetic evolution", Enferm Infecc Microbiol Clin, 30(4), pp. 10 -17.
9. Baras B, S.K, Simon JH, Thoolen RJMM, Mossman SP, Pistoor FHM, et al