Vi rút cúm có nhiều phân týp khác nhau với hệ vật chủ đa dạng: ngƣời, gia cầm, gia súc, chim hoang dã…, tuy nhiên chỉ có một số phân týp vi rút cúm đƣợc ghi nhận gây dịch bệnh phổ biến cho ngƣời nhƣ A/H1N1, A/H3N2 và B. Cho dù số phân týp lƣu hành và gây bệnh cho ngƣời rất hạn chế nhƣng con ngƣời vẫn tiếp tục nhiễm bệnh nhiều lần trong suốt cuộc đời, nguyên nhân của hiện tƣợng này là do 8 phân đoạn gen trong cấu trúc hệ gen của vi rút cúm thƣờng xuyên xuất hiện đột biến thông qua cơ chế “trôi” và “trƣợt” kháng nguyên trong quá trình nhân lên, tiến hóa của vi rút cúm. Do vậy, mỗi năm vắc xin cúm mùa đều phải cập nhật để thành phần vi rút trong vắc xin tƣơng thích với vi rút cúm lƣu hành và gây bệnh trên phạm vi toàn cầu. Lý do chính là do miễn dịch tạo ra do vi rút vắc xin trong năm trƣớc có thể sẽ không thể bảo vệ chống lại vi rút đang lƣu hành có sự thay đổi trong hệ gen. Ngoài
ra, kháng thể tạo ra do vắc xin trong cơ thể sẽ giảm theo thời gian và mức độ kháng thể thƣờng thấp sau một năm tiêm chủng [79], [97], [126].
Theo khuyến cáo hàng năm của TCYTTG về chủng vi rút cúm dự tuyển cho thành phần vắc xin cúm cho mùa dịch sắp tới tại khu vực Bắc bán cầu hoặc Nam bán cầu, các công ty sản xuất vắc xin sẽ nhận đƣợc các thông tin về đặc điểm vi rút cúm lƣu hành thu thập từ các giám sát cúm gần nhất và các thông tin về các sinh phẩm liên quan để đánh giá chất lƣợng vắc xin tại các PTN chuẩn thức của TCYTTG. Quá trình bắt đầu sản xuất đến khi lƣu hành vắc xin cúm sẽ đƣợc thực hiện trong 6 tháng (tháng 3 đến tháng 9 hàng năm cho khu vực Bắc bán cầu, tháng 9 đến tháng 3 năm sau cho khu vực Nam bán cầu) [9], [79], [125].
Hiện nay, sự khác biệt rõ rệt giữa các vùng địa lý trong hoạt động giám sát, sự phát triển của những kỹ thuật hiện đại trong phân tích đặc điểm của vi rút cúm cũng nhƣ sự xuất hiện của các vi rút cúm gia cầm có khả năng gây bệnh cho ngƣời (A/H5N1; A/H7N9; A/H9N2; A/H10N8), công tác lựa chọn vi rút cúm dự tuyển cho thành phần vắc xin cúm mùa hoặc chuẩn bị vắc xin đại dịch yêu cầu có sự phát triển và hoàn thiện nhằm đảm bảo các chủng vi rút cúm dự tuyển sản xuất vắc xin có sự tƣơng đồng cao nhất với các vi rút cúm sẽ lƣu hành trong các mùa dịch tiếp theo [46], [84], [89], [93]. Đây là một hoạt động cần có sự phối hợp toàn cầu và các trung tâm cúm quốc gia (NIC) tại các quốc gia và vùng lãnh thổ là các cơ sở cơ bản. Hai trung tâm cúm quốc gia của Việt Nam (Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng và Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh) là thành viên của mạng lƣới này [82].
Sơ đồ 1.1 Quy trình lựa chọn vi rút vắc xin dự tuyển
Toàn bộ các quy trình sản xuất, kiểm soát, kiểm định chất lƣợng vắc xin đều sử dụng quy trình chuẩn (SOP) của TCYTTG và đƣợc cập nhật, đánh giá hàng năm. Kế thừa kinh nghiệm từ đại dịch cúm A(H1N1)pdm09, sự tiếp tục gây bệnh và ảnh hƣởng đến sức khỏe cộng đồng của vi rút cúm A/H5N1 và các vi rút cúm có nguồn gốc từ động vật khác nhƣ A/H7N9 đã yêu cầu duy trì giám sát vi rút cúm trên động vật và củng cố các hoạt động giám sát lồng ghép giữa các cơ quan y tế và thú y. Hiện tại sự phối hợp của TCYTTG, tổ chức nông lâm thế giới (FAO) và tổ chức thú y thế giới (OIE) đã xây dựng các bản thỏa thuận hợp tác để có thể cung cấp các thông tin cập nhật về cúm động vật giúp nâng cao chất lƣợng trong lựa chọn vi rút vắc xin dự tuyển hàng năm [7].
CHƯƠNG II – ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 thu thập tại Miền Bắc, miền Trung và Tây Nguyên đƣợc phân lập tại Trung tâm Cúm Quốc gia, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng trong giai đoạn 2009-2013 từ các nguồn sau:
- Đề tài cấp nhà nƣớc năm 2009 đến năm 2011: Chủng vi rút phân lập từ các bệnh nhân có hội chứng cúm (HCC) định nghĩa theo tiêu chuẩn của Bộ Y tế (sốt trên 380C, ho và/hoặc đau họng).
- Chƣơng trình giám sát cúm quốc gia giai đoạn 2009-2011và chƣơng trình giám sát cúm quốc gia phối hợp với Cơ quan phòng chống bệnh tật Mỹ (CDC-US) giai đoạn 2006-2012 với tiêu chuẩn: Chủng vi rút phân lập từ bệnh nhân có hội chứng cúm (sốt trên 380C, ho và/hoặc đau họng và không có chẩn đoán nào khác).
2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn chủng cúm A(H1N1)pdm09
Chủng cúm A(H1N1)pdm09 phân lập đƣợc tại 3 miền Bắc, miền Trung và Tây Nguyên từ 2009 đến 2013 đạt hiệu giá HA ≥ 8 sau 72-96 giờ khuếch đại trên tế bào MDCK.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả và tiến cứu.
2.2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Sự phân bố các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Năm
Địa điểm thu thập Số chủng vi rút Miền Bắc Miền Trung Tây Nguyên
2009 6 4 4 14 2010 14 5 0 19 2011 2 2 3 7 2012 2 1 1 4 2013 24 5 2 31 Tổng 48 17 10 75
2.2.3. Cỡ mẫu trong nghiên cứu
Cỡ mẫu trong nghiên cứu đƣợc xác định là 75 chủng đƣợc thu thập trong thời gian nghiên cứu theo tiêu chuẩn lựa chọn chủng.
Các chủng đƣợc lựa chọn để đảm bảo tính đại diện cho vụ dịch theo địa điểm và thời gian xảy ra dịch
2.2.4. Các biến số nghiên cứu
Đặc điểm di truyền học
- Phân lập, khuếch đại và lựa chọn chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09
- Giải trình tự chuỗi nucleotide của các gen HA, NA, M, PB1, PB2 và NS1 vi rút cúm A(H1N1)pdm09.
- Xác định đột biến trên gen HA, NA, M và PB2 liên quan đến khả năng tăng độc lực của vi rút, giảm độ nhạy của thuốc kháng vi rút.
Đặc tính kháng nguyên
- Phản ứng ngăn ngƣng kết hồng cầu (HI).
2.2.5. Vật liệu và kĩ thuật xét nghiệm
(Các kỹ thuật được thực hiện tại Trung tâm Cúm Quốc gia, Viện VSDTTƯ)
Lựa chọn 75 chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc sử dụng trong nghiên cứu đƣợc thu thập theo sơ đồ sau:
Sau 42 – 72h khuếch đại Gây nhiễm trên tế bào MDCK
Hiệu giá NKHC HA ≥ 8 Thu thập, lựa chọn chủng (75 chủng) Dịch họng/dịch phế quản (+) A/H1N1/09 đại dịch bằng RT-PCR Hiệu giá KN (Phản ứng NNKHC - HI) Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển Giải trình tự chuỗi Nucleotide của 6 gen HA, NA, PB1, PB2, NS và M Mục tiêu 1: Phân tích đặc điểm di truyền học của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam giai đoạn 2009 – 2013. Mục tiêu 2: Xác định đặc tính kháng nguyên của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09. Mục tiêu 3: Đề xuất chủng vi rút dự tuyển cho vắc xin cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam
Sau 42 – 72h khuếch đại Gây nhiễm trên tế bào MDCK
Hiệu giá NKHC HA ≥ 8 Thu thập, lựa chọn chủng (75 chủng) Dịch họng/dịch phế quản (+) A/H1N1/09 đại dịch bằng RT-PCR Hiệu giá KN (Phản ứng NNKHC - HI) Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển Giải trình tự chuỗi Nucleotide của 6 gen HA, NA, PB1, PB2, NS và M Mục tiêu 1: Phân tích đặc điểm di truyền học của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam giai đoạn 2009 – 2013. Mục tiêu 2: Xác định đặc tính kháng nguyên của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09. Mục tiêu 3: Đề xuất chủng vi rút dự tuyển cho vắc xin cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam
Sau 42 – 72h khuếch đại Gây nhiễm trên tế bào MDCK
Hiệu giá NKHC HA ≥ 8 Thu thập, lựa chọn chủng (75 chủng) Dịch họng/dịch phế quản (+) A/H1N1/09 đại dịch bằng RT-PCR Hiệu giá KN (Phản ứng NNKHC - HI) Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển Giải trình tự chuỗi Nucleotide của 6 gen HA, NA, PB1, PB2, NS và M Mục tiêu 1: Phân tích đặc điểm di truyền học của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam giai đoạn 2009 – 2013. Mục tiêu 2: Xác định đặc tính kháng nguyên của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09. Mục tiêu 3: Đề xuất chủng vi rút dự tuyển cho vắc xin cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam
Sau 42 – 72h khuếch đại
Gây nhiễm trên tế bào MDCK
Hiệu giá NKHC HA ≥ 8 Thu thập, lựa chọn chủng (75 chủng) Dịch họng/dịch phế quản (+) A(H1N1)pdm09 bằng RT-PCR Hiệu giá KN (Phản ứng NNKHC - HI) Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển Giải trình tự chuỗi Nucleotide của 6 gen HA, NA, PB1, PB2, NS và M Mục tiêu 1: Phân tích đặc điểm di truyền học của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam giai đoạn
2009 – 2013. Mục tiêu 2: Xác định đặc tính kháng nguyên của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09. Mục tiêu 3: Đề xuất chủng vi rút dự tuyển cho vắc xin cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam
2.2.5.1 Phân lập, khuếch đại và lựa chọn chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09
Sau khi xác định bệnh phẩm nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 bằng phƣơng pháp RT-PCR hoặc real time RT-PCR. (Xem phần phụ lục)
Phân lập vi rút:
Sinh phẩm cho phƣơng pháp phân lập vi rút
Sinh phẩm Xuất xứ
Tế bào thận chó MDCK
(Madin-Darby Canine Kidney) CDC
Chai nuôi cấy tế bào T-25 Corning Cat.No. 430720 Dulbecco’s Modified Eagle
Medium (D-MEM) GIBCO Cat.No. 11965-092
Penicillin-Streptomycin, dạng dung dịch đặc (10,000 U/ml penicillin G; 10,000 μg/ml streptomycin sulfate)
GIBCO Cat.No. 15140-023
Dung dịch Bovine serum albumin
fraction V, 7.5% GIBCO Cat.No. 15260-011
Fetal bovine serum, 40 nm filtered HyClone Laboratories, Inc Cat.No. A-1111-L
Trypsin-EDTA (0.05% trypsin;
0.53 mM EDTA.4Na) GIBCO Cat.No. 25300-054
Trypsin, TPCK Sigma Cat.No. T-8642
Gentamicin reagent dạng dung dịch
(50 mg gentamicin sulfate/ml) GIBCO Cat.No 15750-011
Cồn (96-100%) Merck Cat.No.1.00983.1000
Chuẩn bị dụng cụ, vật liệu.
- Lựa chọn tế bào MDCK mọc đẹp thành một lớp trong chai nuôi cấy tế bào 25 cm2 (Corning Cat.No. 430720).
- Dung dịch phát triển gồm: D-MEM x10, Fetal Bovine Serum 7,5%, Penicillin 100 U/ml và Streptomycin 100 µg/ml, NaHCO3 và nƣớc cất hai lần vô trùng.
- Dung dịch môi trƣờng nuôi cấy vi rút gồm: D-MEM x10, Bovine serum albumine 2%, Penicillin 100 U/ml và Streptomycin 100 µg/ml, TPCK- treated trypsin và nƣớc cất hai lần vô trùng.
- Trypsin treated - TPCK
Chuẩn bị Trypsin treated - TPCK
- Kháng sinh để xử lý bệnh phẩm: Kanamycin sulfate; Cipro-HCl - Xử lý mẫu bệnh phẩm lâm sàng
(1). Trộn đều bệnh phẩm bằng máy vortex. Loại bỏ tăm bông ngoáy họng. (2). Thêm 20 µl kháng sinh xử lý bệnh phẩm.
(3). Để tại nhiệt độ phòng 30-45 phút. (4). Sử dụng mẫu để phân lập.
- Phân lập trên tế bào MDCK
(1). Chọn chai tế bào MDCK 25 cm2 mọc đẹp 1 lớp.
(2). Loại bỏ môi trƣờng phát triển, rửa tế bào 2 lần bằng PBS (-) và 1 lần bằng môi trƣờng D-MEM chứa 2 µg/ml TPCK trypsin.
(3). Gây nhiễm 250 µl bệnh phẩm, ủ 370C/60 phút
(4).Thêm 1,5 ml môi trƣờng nuôi cấy vi rút BSA 2%, Trypsin. Ủ 370C/7 ngày (5). Quan sát sự huỷ hoại tế bào (CPE) qua kính hiển vi lộn ngƣợc hàng ngày. Khuếch đại và lựa chọn chủng vi rút
1.Các chủng vi rút thu hoạch đƣợc tiến hành khuếch đại trên chai tế bào MDCK 75 cm3 mọc đẹp 1 lớp.
2.Lựa chọn các chai tế bào có hủy hoại xuất hiện CPE từ 72 đến 96 giờ sau khi gây nhiễm.
3.Kiểm tra hiệu giá bằng phản ứng ngƣng kết hồng cầu gà hoặc chuột lang (HA) có sử dụng các kháng huyết thanh chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới. 4.Thu hoạch và cất giữ tại -800C các chủng vi rút có hiệu giá HA ≥ 8 phục vụ
cho nghiên cứu.
5.Lựa chọn 75 chủng vi rút cúm phân lập đƣợc năm 2009 - 2010 đại diện cho 3 khu vực miền Bắc – Trung – Tây Nguyên lƣu hành ở các thời điểm khác nhau để tiến hành giải trình tự chuỗi nucleotide.
2.2.5.2 Giải trình tự chuỗi nucleotide các phân đoạn gen HA, NA, M, NS, PB1 và PB2.
Sinh phẩm sử dụng bộ sinh phẩm tách chiết ARN: QIAamp viral RNA Mini Kit, 250 preps, catalog 52904, Qiagen
Tạo đoạn DNA bổ sung
- Mồi Universal 12 (Invitrogen)
- Enzyme Superscript III reverse transcriptase – Invitrogen (Mã catalog 18080085).
Sinh phẩm cho PCR
- PCR kit: + Qiagen HotStar Hifidelity (Mã catalog 202602) + Qiagen One step RT-PCR (Mã catalog 210212)
- Hệ thống mồi sử dụng giải trình chuỗi nucleotide 6 gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 (Xem phụ lục)
Sinh phẩm tinh sạch sản phẩm PCR
- Kit làm tinh sạch sản phẩm PCR (khi sản phẩm PCR thu đƣợc một băng đặc hiệu) của hãng Qiagen: Purification kit Qiaquick (250) Mã catalog 28106
- Kit làm tinh sạch sản phẩm PCR (khi sản phẩm PCR thu đƣợc một gồm nhiều băng không đặc hiệu, trong số đó có băng là sản phẩm mong muốn) của hãng Qiagen: Qiaquick Gel Extraction kit (250) Mã catalog 28706
- Kit làm tinh sạch sản phẩm sau khi chạy chu trình nhiệt gắn dideoxynucleotide của hãng Qiagen: DyeEx 2.0 Spin kit Qiagen Mã catalog 63206
* Giải trình tự gen
- Kit BigDye Terminator v3.1 ABI. Mã catalog 4336917
- Polymer: POP 7 ABI. Mã catalog 4352759
Phƣơng pháp giải trình tự gen.
Sử dụng phƣơng pháp giải trinh tự gen truyền thống (Sanger) với máy giải trình tự nucleotide ABI 3130.
Hình 2.1 Quy trình giải trình tự gen
Tách chiết ARN: Sử dụng bộ sinh phẩm của hãng QIAgen (CHLB Đức) để tách chiết ARN của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 có hiệu giá HA ≥ 8.
1. Trộn đều 140 l mẫu thử (dịch mũi họng, dịch súc họng, dịch nổi nuôi tế bào…) với 560 l đệm AVL. Để 10 phút.
2. Thêm 560 l ethanol (100%) vào hỗn dịch trên, trộn đều.
3. Đặt cột QIAamp spin vào ống ly tâm 2ml sạch. Tách 630 l hỗn dịch vào cột QIAamp spin. Ly tâm 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ ống ly tâm. Lặp lại (3).
4. Đặt cột QIAamp spin vào ống ly tâm sạch, rửa cột QIAamp spin bằng 500
l đệm AW1, ly tâm 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ ống ly tâm.
5. Tiếp tục rửa cột QIAamp spin bằng 500 l đệm AW2, ly tâm 14000 vòng/phút/ 3 phút. Loại bỏ ống ly tâm.
6. Đặt cột QIAamp spin vào ống ly tâm sạch. Cho 60 l nƣớc cất tinh khiết, ủ 2 phút, ly tâm 8000 vòng/phút/1 phút. Loại bỏ cột QIAamp spin. Phần dung dịch thu đƣợc trong ống ly tâm chính là ARN của vi rút.
Tổng hợp sợi ADN bổ trợ (cDNA)
Tạo hỗn hợp 1 Tạo hỗn hợp 2 Thành phần Mồi Uni12 dNTP ARN 1 phản ứng (l) 5 1 10 Thành phần Đệm x5 DTT RNase inhibitor SuperscriptIII RT enzyme 1 phản ứng (l) 5 1 1 1 Ủ 650
C/ 5 phút. Giữ lạnh ngay Giữ lạnh
Trộn hỗn hợp 1 và hỗn hợp 2, ủ nhiệt độ 43oC/45 phút, 70oC/15 phút, sau đó lƣu giữ tại -20o
C, làm mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại các phân đoạn gen HA, NA, M, PB1, PB2 và NS.
Khuếch đại các phân đoạn gen:
Các phân đoạn gen nghiên cứu đƣợc khuếch đại theo thƣờng quy của Trung tâm Cúm quốc gia, Viện VSDTTW.
- Thành phần hỗn hợp phản ứng PCR Sinh phẩm 1 phản ứng Đệm 10x 10 µl Mồi xuôi (100 nM) 0.5 µl Mồi ngƣợc (100 nM) 0.5 µl HotStar Taq 2 µl Nƣớc tinh sạch 29 µl cDNA 8 µl Tổng 50 µl
Mồi: Sử dụng hệ thống mồi để giải trình tự gen HA, NA, M, NS, PB1 và PB2.
- Chu kỳ nhiệt
Gen Chu kỳ nhiệt
HA, PB1, PB2 94 0 C 2:00 940C 0:20 500C 0:30 720C 1:00 720C 7:00 40C ∞ x 29 chu kỳ NA, NS, M 95 0 C 5:00 940C 1:00 520C 1:00 720C 3:00 720C 7:00 40C ∞ x40 chu kỳ * Điện di sản phẩm PCR: trên thạch 1%, sử dụng thang trọng lƣợng phân tử 1kb.
Tinh sạch sản phẩm PCR
Mục đích: Loại bỏ những sinh phẩm và mồi thừa, sẽ gây nhiễu trong quá trình giải trình tự.
Nếu sản phẩm PCR sau khi điện di cho kết quả đặc hiệu:
Thành phần Cột Qiaquick 250 chiếc
Đệm PB 150 ml
Đệm PE 55 ml
Đệm EB 15 ml
Týp 2 ml 250 chiếc
Chú ý: Thêm 220 ml cồn tuyệt đối (96-100%) vào đệm PE trƣớc khi sử dụng Các bƣớc tiến hành