Toàn bộ 13 chủng vi rút đƣợc lựa chọn (bảng 3.14) tiến hành thử nghiệm ngƣng kết hồng cầu, để đánh giá khả năng khuếch đại của vi rút trên hệ thống tế bào nuôi MDCK, thông qua hiệu giá HA sau 5 lần cấy chuyển với xuất phát điểm HA ≥ 128 và kiểm tra đặc tính kháng nguyên bằng phản ứng ngăn ngƣng kết hồng cầu (HI) với kháng huyết thanh chuẩn (sheep antisera A/California/07/09).
Bảng 3.15 Kết quả HA và HI của các vi rút trong nhóm lựa chọn vắc xin dự tuyển.
Số
TT Vi rút HA gốc
Hiệu giá HA sau 5 lần cấy chuyển Kết quả HI M1 M2 M3 M4 M5 1 HN 36945 64 Không thực hiện 2 HN 36946 128 128 256 128 64 64 1280 3 HN 36947 128 128 256 256 512 >512 1280 4 HN 36942 128 128 32 128 64 64 1280 5 HN 36944 128 64 32 32 32 32 1280 6 37043 32 Không thực hiện 7 NH 13284 128 128 128 256 256 256 1280 8 NH 13111 128 64 128 128 64 64 640 9 36947 128 128 256 256 64 64 1280 10 36978 128 128 128 256 128 256 1280 11 37223 128 128 512 128 128 128 1280 12 37047 128 128 64 64 128 128 640 13 IS0913135 128 64 32 32 32 32 320
Hình 3.13 Kết quả khuếch đại vi rút trong nhóm lựa chọn vắc xin dự tuyển.
Kết quả bảng 3.15 cho thấy: có 11/13 vi rút có hiệu giá HA = 128 trƣớc khi cấy chuyển và sau 5 lần cấy chuyển chỉ có 3/11 vi rút có sự tăng hiệu giá HA ≥ 256 (HN36947; NH13284 và 36978), đƣợc xác định có khả năng khuếch đại tốt trên hệ thống tế bào nuôi. Kết quả HI sau 5 lần cấy chuyển cũng cho thấy đa số các vi rút (8/11 vi rút) ổn định về hiệu giá ngƣng kết hồng cầu (HA) cho phép nghĩ đến sự tƣơng đồng cao về đặc tính kháng nguyên sau quá trình cấy chuyển khi đạt hiệu tƣơng đƣơng với hiệu giá HI của vi rút vắc xin chuẩn HI=1280 (Bảng 3.14).
Với kết quả phân tích trên, có 03 vi rút: A/Vietnam/HN36947;
A/Vietnam/NH13284 và A/Vietnam/36978/2013 có khả năng khuếch đại với hiệu giá cao và ổn định về đặc tính kháng nguyên, tuy nhiên vi rút A/Vietnam/36978/2013 trong quá trình khuếch đại, hiệu giá HA không duy trì sự ổn định khi đã đạt ngƣỡng (HA giảm tại M4 và tăng lại tại M5) (bảng 3.14, hình 3.12). Nhƣ vậy có 2 vi rút A/Vietnam/HN36947 và A/Vietnam/NH13284 trong nghiên cứu có khả năng sử dụng là vi rút dự tuyển cho phát triển vắc xin cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam.
CHƯƠNG IV – BÀN LUẬN.
4.1.Sự lƣu hành của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam, 2009 - 2013.
Sau 40 năm, kể từ đại dịch cúm châu Á (A/H3N2) xuất hiện tại Hồng Kông năm 1967-1968, một lần nữa thế giới lại ghi nhận sự xuất hiện và gây thành đại dịch trên toàn cầu của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 vào tháng 3 năm 2009 [109]. Đến tháng 5 năm 2009 xuất hiện tại Việt Nam là nƣớc thứ 54 trên thế giới thông báo về sự lƣu hành của vi rút cúm A(H1N1)pdm09. Sự lan rộng của vi rút tại các quốc gia, vùng lãnh thổ khác trên thế giới kể cả các nƣớc ở Nam bán cầu, nơi mùa đông (mùa cúm) bắt đầu, ngày 11/6/2009 Tổ chức Y tế Thế giới đã chính thức công bố một đại dịch mới cúm đầu tiên trong thế kỷ XXI vi rút cúm A(H1N1)pdm09 [114]. Cũng giống nhƣ vi rút cúm gây đại dịch ở thế kỷ trƣớc, sau khi gây bệnh và lan truyền với tốc độ nhanh, cao trào trên toàn thế giới, đến ngày 10/8/2009 TCYTTG đã tuyên bố chấm dứt giai đoạn biểu hiện đại dịch của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 và vi rút này tiếp tục lƣu hành nhƣ các vi rút cúm mùa A/H3N2 và B [109], [119].
Theo số liệu chƣơng trình Giám sát Cúm Quốc gia (NISS), sự xuất hiện và lan rộng các chùm ca bệnh trong cộng đồng đã duy trì sự lan truyền của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trên toàn cầu cũng nhƣ tại Việt Nam, trong khoảng thời gian từ tháng 7/2009 đến tháng 1/2010, vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đã lƣu hành chiếm ƣu thế. Sự tiếp tục lƣu hành của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 cũng là sự chấm dứt xuất hiện của vi rút cúm mùa A/H1N1, kết quả giám sát của chúng tôi tƣơng tự với báo cáo của của hệ thống giám sát cúm toàn cầu (GISRS). Sự thay thế và lƣu hành trong các năm tiếp sau đại dịch từ năm 2011 đến năm 2013 đã cho thấy vi rút cúm A(H1N1)pdm09 hoàn toàn chuyển đổi phƣơng thức lây truyền của vi rút cúm gây đại dịch thành vi rút cúm mùa và các đặc điểm vi rút học cũng sẽ tiến hóa theo kiểu vi rút cúm mùa.
Với sự lƣu hành và gây dịch có tính chất theo mùa, việc theo dõi, giám sát sự thay đổi về đặc điểm di truyền, đặc tính kháng nguyên và một số biểu hiện gây bệnh liên quan của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sẽ là một nhiệm vụ trong giám sát cúm tại Việt Nam và của hệ thống giám sát cúm toàn cầu. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi đã đáp ứng các yêu cầu trong giám sát vi rút học của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam trong giai đoạn 2009-2013.
4.2.Lựa chọn vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu.
Đối tƣợng nghiên cứu của chúng tôi đƣợc xác định là toàn bộ chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09, thu thập sau 72-96 giờ sau khi khuếch đại trên tế bào MDCK đƣợc xác định nồng độ vi rút bằng phƣơng pháp ngƣng kết hồng cầu gà (HA), có hiệu giá HA ≥ 8 đƣợc lựa chọn.
Mục đích phân tích trình tự 6 phân đoạn gen và protein tƣơng ứng (HA; NA; M; NP; PB1 và PB2). Vì vậy lựa chọn vi rút trong nghiên cứu phải đảm bảo đƣợc:
+ Đại diện theo thời gian lƣu hành
+ Đảm bảo tính đại diện theo khu vực (phân lập từ các điểm giám sát trong hệ thống giám sát)
+ Đảm bảo chất lƣợng chủng vi rút.
Kết quả bảng 3.1 cho thấy tổng số 75 chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 phân lập sử dụng trong nghiên cứu đƣợc thu thập trong giai đoạn 2009 – 2013, số lƣợng vi rút lựa chọn khác nhau phụ thuộc vào cƣờng độ lƣu hành của vi rút tại các năm, vì vậy số lƣợng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu của chúng tôi thu thập với số lƣợng hạn chế 7 vi rút năm 2011 và 4 vi rút năm 2012. Số lƣợng vi rút đƣợc lựa chọn từ năm 2009 (14 vi rút) và 2010 (19 vi rút) cũng tƣơng đồng với cƣờng độ dịch tại các năm đó. Một yêu cầu quan trọng trong nghiên cứu đó là chất lƣợng vi rút, với mục đích đảm bảo sự thành công trong khuếch đại và tách các phân đoạn gen với các kích cỡ
khác nhau, chúng tôi lựa chọn các vi rút có nồng độ tƣơng đƣơng 8 đơn vị ngƣng kết hồng cầu (HA ≥ 8), nên có thể thấy sự không tƣơng đồng về số lƣợng vi rút sử dụng trong các năm 2009 - 2013. Điều này có thể giải thích, vi rút phân lập tại năm 2009 và 2010 là những năm đầu của nghiên cứu có thể bị tác động trong quá trình bảo quản, vì vậy khi tiến hành lựa chọn vi rút bằng phƣơng pháp ngƣng kết hồng cầu (HA), số lƣợng vi rút đảm bảo tiêu chuẩn sẽ bị hạn chế, điều này thể hiện rõ khi năm 2013 số lƣợng vi rút đƣợc sử dụng là 31 (chiếm 41,4%) tổng số vi rút (bảng 3.1). Tuy nhiên, nghiên cứu cũng đã đảm bảo một số lƣợng vi rút cần thiết đại diện cho toàn bộ giai đoạn nghiên cứu.
4.3.Kết quả phân tách, khuếch đại và giải trình tự 6 phân đoạn gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09. vi rút cúm A(H1N1)pdm09.
Vật liệu di truyền của vi rút cúm A bao gồm 8 phân đoạn gen, tuy nhiên trong nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào 6 phân đoạn gen: HA, NA, M, NS, PB1 và PB2. Dựa trên vai trò, chức năng của từng phân đoạn gen và protein tƣơng ứng trong hoạt động chức năng của vi rút cúm A, chúng tôi lựa chọn 6 phân đoạn gen tƣơng đƣơng 8 protein nghiên cứu với mục đích:
- Tìm hiểu sự thay đổi của kháng nguyên bề mặt (HA1, HA2, NA) liên quan đến sự tiến hóa của vi rút cúm.
- Tìm hiểu sự thay đổi của một số axit amin liên quan đến khả năng làm giảm sự cảm nhiễm (độ nhạy) của vi rút với thuốc kháng vi rút oseltamivir trên protein NA.
- So sánh trình tự axit amin phát hiện các “dấu ấn” tại các vị trí đặc biệt trên protein PB1, PB2, M1, M2 và NS để phân biệt giữa vi rút cúm ngƣời và vi rút cúm gia cầm hoặc động vật khác đƣợc ghi nhận là các dấu hiệu của hiện tƣợng trao đổi và tích hợp của vi rút cúm A, căn nguyên tiềm tàng cho sự xuất hiện một vi rút cúm mới có khả năng gây dịch hoặc đại dịch.
Kết quả chúng tôi đã tiến hành phân tích đƣợc trình tự gen của 75 protein HA, 52 protein NA và 50 protein M, 47 protein NS, 36 protein PB1 và 45 protein PB2 từ 75 chủng vi rút sử dụng trong nghiên cứu. Sự thành công trong việc phân tách, khuếch đại và giải trình tự các phân đoạn gen của vi rút cúm bằng phƣơng pháp RT- PCR phụ thuộc vào độ dài, tính ổn định, bản chất protein của từng phân đoạn gen và điều kiện thực hiện kỹ thuật. Tuy số lƣợng các phân đoạn gen đƣợc phân tích trong nghiên cứu khác nhau, nhƣng cũng đảm bảo chất lƣợng của nghiên cứu khi kết quả phân tích của từng phân đoạn gen đều có đại diện vi rút lƣu hành trong các năm nghiên cứu (Bảng 3.2).
4.4.Kết quả phân tích cây gia hệ HA, NA, M, NS, PB1 và PB2 của vi rút cúm A(H1N1)pdm09. cúm A(H1N1)pdm09.
Phân tích cây gia hệ đƣợc tiến hành trên 6 phân đoạn gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 (hình 3.3 - hình 3.9) trong nghiên cứu cho thấy các vi rút lƣu hành tại Việt Nam thƣờng tập trung thành nhóm theo năm: phân nhóm 6A; 6C của cây gia hệ HA là các vi rút lƣu hành năm 2013 (hình 3.3); nhóm 3 cây gia hệ NA hoặc nhóm 2 cây gia hệ M, NS đƣợc tập trung các vi rút lƣu hành năm 2009 - 2010 (hình 3.4; hình 3.6; hình 3.7)…. Kết quả trên cho thấy sự tƣơng đồng về di truyền theo thời gian trong sự tiến hóa của vi rút cúm A(H1N1)pdm09. Trong 6 cây gia hệ đƣợc phân tích, sự phân tách thành nhiều nhóm đƣợc quan sát tại cây gia hệ HA và NA (9 nhóm/phân nhóm), trong khi các cây gia hệ khác chỉ phân tách thành 5-6 nhóm/phân nhóm (M, NS, PB1 và PB2).
Kết quả trên cho thấy sự tiến hóa của các phân đoạn gen trong hệ gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 không đồng đều, sự tiến hóa nhanh hơn của phân đoạn gen HA và NA có thể giải thích do 2 phân đoạn gen này đƣợc biểu hiện với chức năng kháng nguyên bề mặt của vi rút cúm. Vì vậy sẽ chịu tƣơng tác nhiều từ kháng thể kháng vi rút cúm tồn lƣu từ các vật chủ và sự thay đổi
nucleotide trong phân đoạn gen trong quá trình nhân lên trong vật chủ là kết quả của quá trình gây nhiễm.
Sự lƣu hành của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trên toàn cầu, kể từ khi xuất hiện (3/2009) đến hiện tại đã đƣợc ghi nhận có sự tiến hóa nhanh thành 7 nhóm chính (từ nhóm 1 đến 7) qua phân tích gia hệ toàn hệ gen HA [8]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy, sự tiến hóa và tách nhóm/phân nhóm của gen HA và NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam cũng tƣơng đồng với sự tiến hóa của vi rút này trên thế giới. Theo dõi tại Trung tâm kiểm soát và phòng chống bệnh châu Âu (ECDC) cho thấy: trong thời gian lƣu hành 2009-2013, gen HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đã phân tách thành 7 nhóm từ vi rút gốc A/California/07/09 và các vi rút lƣu hành trong năm 2013 tại châu Âu tập trung trong nhóm 6 và 7, các thông báo khác tại Tunisia và Đài Loan cũng cho kết quả tƣơng tự [26], [35], [36]. Nhƣ vậy vi rút A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam có sự tƣơng đồng về gen HA không chỉ với các vi rút lƣu hành tại các nƣớc láng giềng: Thái Lan, Trung Quốc… mà còn tƣơng đồng với các vi rút lƣu hành trên thế giới trong cùng thời gian.
Tƣơng tự, các cây gia hệ M, NS, PB1 và PB2 đều thể hiện sự tƣơng đồng cao về trình tự chuỗi nucleotide của các vi rút A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam và các nƣớc láng giềng và trên thế giới trong thời gian nghiên cứu. Ngoài ra, sự tƣơng đồng cao giữa các vi rút lƣu hành trong năm 2009- 2010 hoặc 2013 đƣợc ghi nhận rõ nét khi những vi rút này tập trung vào một nhóm: nhóm 2 là vi rút lƣu hành 2009-2010; nhóm 6 là các vi rút lƣu hành năm 2013. Kết quả quan sát đƣợc trên tất cả các cây gia hệ M, NS, PB1 và PB2 trong nghiên cứu khẳng định chƣa xuất hiện sự trao đổi và tích hợp của các phân đoạn gen này trong quá trình lƣu hành tại Việt Nam, cho thấy sự ổn
định về di truyền học của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 từ khi xuất hiện đến hiện tại.
Đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam đƣợc thực hiện chủ động, toàn diện trong khuôn khổ hệ thống giám sát cúm quốc gia. Tuy phạm vi phân tích mới chỉ tập trung đƣợc tại khu vực Bắc, Trung và Tây nguyên của Việt Nam, nhƣng thông tin về sự tiến hóa di truyền của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu cũng cho phép nhận định chung cho toàn Việt Nam khi các vi rút sử dụng trong nghiên cứu có độ tƣơng đồng di truyền cao với các nƣớc láng giềng và trên toàn cầu (hình 3.2 đến hình 3.9).
Các phƣơng pháp tiến hành và phần mềm phân tích số liệu trong nghiên cứu đều đảm bảo cập nhật và tiêu chuẩn và đƣợc áp dụng hợp lý nên đảm bảo tính chính xác, độ tin cậy của kết quả nghiên cứu. Chúng tôi sử dụng thuật toán Maximum likelihood trong xây dựng cây gia hệ các phân đoạn gen trong nghiên cứu để có thể xác định xác suất tạo ra cây (tree) hoặc chiều dài của nhánh (branch lengths) để có thể đƣa ra một mô hình cụ thể của quá trình tiến hóa phân tử trên cơ sở các dữ liệu trình tự thu thập đƣợc.
Chúng tôi phân tích 6 cây gia hệ của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu đều sử dụng vi rút vắc xin A/California/07/09 làm gốc và các nhóm trên cây đƣợc hình thành trên cơ sở giá trị boostrap >70 với sự lặp lại của boostrap là 1000. Kết quả của chúng tôi cho thấy trên 3 cây gia hệ NA, M và NS, các vi rút A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam, 2009-2013 bắt đầu xuất hiện trong nhóm 2, trong khi các cây gia hệ HA, PB1 và PB2 xuất hiện các vi rút lƣu hành tại Việt Nam trong nhóm 1 cùng nhóm với vi rút vắc xin. Thêm vào đó, các phân đoạn gen của một vi rút đơn lẻ cũng không thể hiện sự tƣơng đồng khi phân đoạn gen HA có thể trong nhóm 6C trong khi phân đoạn gen NA lại nằm trong nhóm 6B (bảng 3.15) có thể gợi ý sự tiến hoá không đồng đều giữa các phân đoạn gen của một vi rút A(H1N1)pdm09.
Do cỡ mẫu phân tích thực tế trong một năm nghiên cứu không nhiều, dao động từ 4 chủng vi rút năm 2011 đến 31 chủng vi rút năm 2013 nên phân tích sự tiến hoá trong từng năm thông qua phân tích cây gia hệ không thể thực hiện đƣợc, tuy nhiên tổng thể của 75 chủng vi rút trong giai đoạn nghiên cứu cũng đủ thông tin về sự tiến triển của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại một quốc gia và có góp phần hoàn thiện hệ thống giám sát cúm toàn cầu khi Trung tâm cúm Quốc gia của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ƣơng là thành viên của hệ thống giám sát.
4.5.Kết quả phân tích protein HA, NA, M1, M2 , NS1, NS2, PB1 và PB2 của vi rút cúm A(H1N1)pdm09.
4.5.1. Protein HA
Protein HA và NA là các kháng nguyên bề mặt của vi rút cúm có chức năng quyết định các hoạt động lây nhiễm của vi rút cúm A tới vật chủ cũng nhƣ kích hoạt cơ chế miễn dịch bảo vệ của cơ thể khi bị nhiễm vi rút cúm. Protein HA đã đƣợc ghi nhận liên quan đến hoạt động dính bám vào thụ cảm thể trong quá trình tiếp cận với tế bào chủ, quyết định độc lực của vi rút cúm