Nghiên cứu là một nhánh của đề tài nghiên cứu cấp nhà nƣớc (Mã số ĐTĐL 2009G/55) và chƣơng trình giám sát cúm quốc gia giai đoạn 2009- 2011 tại khu vực miền Bắc Việt Nam, phối hợp với Cơ quan phòng chống bệnh tật Mỹ (CDC-US) giai đoạn 2006-2012. Vì vậy, Y đức trong nghiên cứu đã đƣợc phê duyệt bởi Hội đồng Y đức - Bộ Y tế và Trung tâm kiểm soát và phòng chống bệnh tật Mỹ (CDC-US).
CHƯƠNG III – KẾT QUẢ
3.1. Lựa chọn chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu.
Trong thời gian nghiên cứu vi rút cúm đƣợc phân lập từ các mẫu bệnh phẩm dịch họng thu thập tại miền Bắc, miền Trung và Tây Nguyên trên bệnh nhân đƣợc xác định nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 bằng phƣơng pháp RT-PCR hoặc Realtime PCR tại các điểm giám sát trong chƣơng trình giám sát cúm quốc gia. Sử dụng dòng tế bào thận chó thƣờng trực (MDCK) để phân lập và khuếch đại vi rút cúm A(H1N1)pdm09, vi rút cúm thu thập sau
72-96 giờ sau khi khuếch đại trên tế bào MDCK đƣợc xác định nồng độ vi rút bằng phƣơng pháp ngƣng kết hồng cầu (HA), toàn bộ các vi rút có hiệu giá HA ≥ 8 đƣợc lựa chọn cho nghiên cứu.
Bảng 3.1 Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu.
Năm Số vi rút (n) Tỷ lệ (%) 2009 14 18,7 2010 19 25,3 2011 7 9,3 2012 4 5,3 2013 31 41,4 Tổng 75 100
Kết quả bảng 3.1 cho thấy, vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc thu thập trong nghiên cứu đều đại diện trong các năm, nhiều nhất năm 2013 (31 vi rút), tiếp đến năm 2010 (19 vi rút), 2009 (14 vi rút), các năm 2011 và 2012 là các năm có số lƣợng vi rút đƣợc lựa chọn thấp: 7 vi rút (2011) và 4 vi rút (2012). Các vi rút sử dụng trong nghiên cứu đƣợc thu thập từ năm 2009 - 2013 tại một số tỉnh miền Bắc, miền Trung và Tây nguyên.
3.2.Kết quả PCR phân tách và khuếch đại 6 phân đoạn gen để phân tích trình tự chuỗi nucleotide. trình tự chuỗi nucleotide.
Do cấu trúc hệ gen của vi rút cúm gồm 8 phân đoạn với kích cỡ và cấu trúc khác nhau nên khả năng thành công khi tổng hợp từng phân đoạn bằng phản ứng PCR sẽ thay đổi. Sử dụng các cặp mồi thiết kế cho phân tách (tách biệt) các phân đoạn gen độc lập của vi rút cúm A kết hợp với DNA polymerase Hifi có khả năng khuếch đại và hiệu chuẩn sản phẩm PCR với kích cỡ lớn, các phân đoạn gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc phân tách và khuếch đại với độ đặc hiệu, chính xác cao.
Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR gen HA và NA sử dụng cặp mồi khuếch đại phù hợp cho giải trình tự gen
M : Thang trọng lƣợng phân tử 1kb
Mẫu 1-4 : Các vi rút A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu
Dựa trên kết quả PCR, 6 phân đoạn gen đƣợc tổng hợp bao gồm: HA, NA, M, NS, PB1 và PB2, các phân đoạn gen của cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc lựa chọn để tiến hành phân tích trình tự chuỗi nucleotide.
1778 bp bpbp 1413 bp
bpbp
Bảng 3.2 Kết quả tổng hợp 6 phân đoạn gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 bằng phản ứng PCR Phân đoạn gen Độ dài thu đƣợc (bp) Số vi rút (n) Tổng (n) Tỷ lệ (%) 2009 2010 2011 2012 2013 HA 1778 14 19 7 4 31 75 100 NA 1413 6 16 4 2 24 52 69,3 M 1027 12 18 3 4 13 50 66,7 NS 890 8 18 3 4 14 47 62,7 PB1 2299 3 14 3 4 12 36 48 PB2 2185 7 18 3 4 13 45 60
Kết quả bảng 3.2 cho thấy tổng số 75 chủng vi rút cúm phân lập đạt hiệu giá HA≥ 8 đều thành công trong việc phân tách và khuếch đại phân đoạn gen HA đạt tỷ lệ 100%, trong khi phân đoạn gen NA thu đƣợc 52/75 vi rút (đạt 69,3%), các phân đoạn gen M thu đƣợc 50/75 (đạt 66,7%), NS 47/75 (đạt 62,7)% và PB2 45/75 (đạt 60%) và phân đoạn gen PB1 thu đƣợc từ 36/75 (đạt 48%).
3.2.1. Đặc điểm di truyền phân đoạn gen HA
3.2.1.1 Cây gia hệ phân đoạn gen HA.
Cây gia hệ phân đoạn gen HA đƣợc xây dựng với vi rút gốc là A/California/07/09 và 75 chủng vi rút với phân đoạn gen HA có độ dài 1778 nucleotide sử dụng trong nghiên cứu cùng với các vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại các nƣớc láng giềng trong cùng giai đoạn (Thái Lan, Trung Quốc…). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy: các vi rút cúm A(H1N1)pdm09 kể từ khi xuất hiện (3/2009) và lƣu hành đến hiện tại trên thế
giới đƣợc nhóm thành 7 nhóm chính (nhóm 1 đến 7), trong đó nhóm 6 đƣợc tách thành các phân nhóm 6A; 6B và 6C [35].
Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam sử dụng trong nghiên cứu cũng tập hợp 7 nhóm chính (Hình 3.2). Kết hợp với phân tích sự tƣơng đồng trên các vi rút lƣu hành trong khu vực và trên thế giới, các vi rút sử dụng trong nghiên cứu đƣợc tập hợp trong nhóm/ phân nhóm của cây gia hệ cụ thể nhƣ sau:
- Nhóm 1: gồm 01 vi rút phân lập năm 2009 và cùng nhóm với vi rút gốc A/California/07/09 cũng nhƣ các vi rút lƣu hành tại Thái Lan, Trung Quốc trong cùng năm 2009.
- Nhóm 2: gồm 02 vi rút phân lập năm 2009, 02 vi rút phân lập năm 2010 và một số vi rút lƣu hành năm 2009 tại Thái Lan, Trung Quốc.
- Nhóm 3: gồm 03 vi rút phân lập năm 2009 và 08 vi rút phân lập năm 2010 cùng với một số vi rút lƣu hành năm 2009-2010 tại Thái Lan, Trung Quốc.
- Nhóm 4: gồm 08 vi rút còn lại phân lập năm 2009 và tập hợp cùng một số vi rút lƣu hành tại Thái Lan, Trung Quốc năm 2009-2010.
- Nhóm 5: 09 vi rút còn lại phân lập năm 2010 và một số lƣu hành tại Mỹ, Thái Lan, Trung Quốc năm 2010-2012.
- Phân nhóm 6A: gồm 07 vi rút phân lập năm 2013, cùng với vi rút lƣu hành tại Iran. Không có vi rút nào xuất hiện phân nhóm 6B
- Phân nhóm 6C: là phân nhóm lớn gồm 23 vi rút phân lập năm 2013 và 01vi rút phân lập năm 2011 cùng với một số vi rút phân lập tại Mỹ, Iran, Trung Quốc, Ấn độ năm 2012-2013.
- Nhóm 7: là tập hợp của 06 vi rút phân lập năm 2011, 04 vi rút phân lập năm 2012 và 01 vi rút phân lập năm 2013 cùng một số vi rút lƣu hành tại Mỹ, Nga, Thái Lan năm 2010-2013. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.2 Cây gia hệ HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam, 2009-2013.
Nhóm 1: VN/2009 Nhóm 2: VN/2009-VN/2010 Nhóm 3: VN/2009-VN/2010 Nhóm 4: VN/2009-VN/2010 Nhóm 5: VN/2010 Nhóm 6A/6C: VN/2013 Nhóm 7: VN/2011-2012 2013 2012 2011 2010 0 2009
Hình 3.3 Số nucleotide trung bình thay đổi trên gen HA của các nhóm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu và vi rút vắc xin
A/California/07/09 (MEGA 5) .
Các vi rút tập trung trong từng nhóm hoặc phân nhóm đều có độ tƣơng đồng về trình tự nucleotide của gen HA từ 99,7% (nhóm) hoặc 99,9% (phân nhóm) với độ lặp lại (boostrap) 1000 lần trong quá trình so sánh trình tự giữa các vi rút. Kết quả hình 3.3 cho thấy sự thay đổi nucleotide của gen HA của vi rút A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu dao động trung bình từ 5 nucleotide (nhóm 1 đến 5) đến 13 nucleotide (phân nhóm 6C) với vi rút vắc xin A/California/07/09. Kết quả trên cho phép xác định độ tƣơng đồng nucleotide của các nhóm/phân nhóm của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 với vi rút vắc xin A/California/07/09 đạt từ 99,3% (phân nhóm 6C) đến 99,7% (nhóm 1-5)
3.2.1.2 Protein HA.
Toàn bộ 75 phân đoạn gen HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu đƣợc dịch mã axit amin và so sánh với protein HA của vi rút vắc xin (vi rút gốc A/California/07/09).
Bảng 3.3 Sự thay đổi (đột biến) axit amin trên protein HA
Nhóm /Phân nhóm
2009 2010 2011 2012 2013 Axit amin thay đổi so với vi rút A/ California/07/09 1 1 P83S, I321V 2 2 2 P83S, I321V, S203T 3 3 8 P83S, I321V, S203T, S84N, I116M 4 8 P83S, I321V, S203T, R223Q. 5 9 P83S, I321V, S203T, R259K, E347K 6A 7 P83S, I321V, S203T, R223Q, D97N, N38D, H138R, S185T , V249L, E374K, S451N 6C 1 23 P83S, I321V, S203T, R223Q, D97N, G155E, N156K, S185T, I216M, D222N, V234I, T241I, K283E, E374K, S451N, E499K
7 6 4 1
P83S, I321V, S203T, R223Q, D97N, S143G, S185T, A197T, N260D, E374K, S451N, E499K
Tổng 14 19 7 4 31 75 chủng vi rút
Kết quả phân tích protein HA của 75 chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu cho thấy sự thay đổi của axit amin của từng nhóm, phân nhóm so với vi rút gốc A/California/07/09 (bảng 3.3) bao gồm :
Nhóm 1: vi rút cúm lƣu hành tại Việt Nam đƣợc xác định có 2 axit amin thay đổi đó là P83S, I321V.
Nhóm 2: Số axit amin thay đổi là 3: P83S, I321V và S203T.
Nhóm 3 và 5 có 5 axit amin thay đổi
Nhóm 4: có 4 axit amin thay đổi.
Phân nhóm 6A: số axit amin thay đổi đƣợc xác định là 11.
Phân nhóm 6C: số axit amin thay đổi đƣợc xác định là 16.
Nhóm 7: axit amin thay đổi đƣợc xác định là 12.
Bảng 3.4 Tần suất thay đổi (đột biến) trên protein HA Nhóm/
phân nhóm
Axit amin thay đổi trên protein HA so với vi rút A/California/07/09 Pro-Ser (P83S) Ile-Val (I321V) Ser-Tyr (S203T) Glu-Lys (E374K) Arg-Gln (R223Q) Asp-Asn (D97N) 1 √ √ 2 √ √ √ 3 √ √ √ 4 √ √ √ √ 5 √ √ √ √ 6A √ √ √ √ √ √ 6C √ √ √ √ √ √ 7 √ √ √ √ √ √
Tần xuất thay đổi (đột biến) của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam so với vi rút gốc A/California/07/09 đƣợc ghi nhận tại một số vị trí axit amin số 83 thay đổi từ Proline thành Serine (P83S) và Isoleucine thành Valine tại axit amin số 321(I321V) xuất hiện trong toàn bộ 75 chủng vi rút sử dụng trong nghiên cứu, tần suất thay đổi là 100%. Tiếp theo thay đổi S203T
đƣợc xác định trong hầu hết các nhóm/phân nhóm từ 2-7 với tần suất 87,5%, các thay đổi R223Q, E374K cũng xuất hiện với tần suất đạt 50% và D97N, S451N đƣợc xác định trong 3 nhóm/phân nhóm (37,5%). Các thay đổi (đột biến) khác xuất hiện đơn lẻ tại 1-2 nhóm/phân nhóm (bảng 3.4).
3.2.2. Đặc điểm di truyền phân đoạn gen NA
3.2.2.1 Cây gia hệ phân đoạn gen NA.
Cây gia hệ phân đoạn gen NA đƣợc xây dựng trên 52 chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu và một số vi rút lƣu hành cùng thời gian trên một số nƣớc trên thế giới: Thái Lan, Hồng Kông, Mỹ, Canada. Tƣơng tự cây gia hệ gen HA, cây gia hệ NA cũng sử dụng vi rút cúm A/California/07/09 làm gốc. Kết quả phân tích cây gia hệ cho thấy gen NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sau 4 năm lƣu hành (2009-2013) tập hợp trong 7 nhóm đƣợc phân tách thành 10 phân nhóm: 1; 2; 3; 4; 5; 6A; 6B; 6C; 7A và 7B đƣợc (hình 3.4):
Nhóm 2: gồm 03 vi rút phân lập năm 2009 và 04 vi rút phân lập năm 2010. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhóm 3: gồm 03 vi rút phân lập năm 2009 và 12 vi rút phân lập năm 2010.
Nhóm 5: gồm 05 vi rút phân lập năm 2013.
Phân nhóm 6B: gồm 05 vi rút phân lập năm 2013.
Phân nhóm 6C: gồm 10 vi rút phân lập năm 2013.
Phân nhóm 7A: gồm 03 vi rút phân lập năm 2011; 01 vi rút phân lập năm 2012 và 01 vi rút phân lập năm 2013.
Phân nhóm 7B: 01 vi rút phân lập năm 2011; 01 vi rút phân lập năm 2012 và 03 vi rút phân lâp năm 2013.
Hình 3.4 Cây gia hệ NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam, 2009-2013
2013 2012 2011 2010 0 2009
Kết quả phân tích cây gia hệ cũng cho thấy:
- Các vi rút phân lập năm 2009-2010 có độ tƣơng đồng cao và tập trung trong nhóm 2 và 3.
- Các vi rút cúm phân lập năm 2013 phân tách nhiều thể hiện trong sự có mặt của những vi rút này tại các nhóm/phân nhóm 5; 6B, 6C, 7A và 7B (hình 3.4)
Hình 3.5 Số nucleotide trung bình thay đổi trên gen NA của các nhóm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu và vi rút vắc xin
A/California/07/09 (Mega 5 sofwave) .
Số nucleotide trung bình thay đổi trên gen NA của 52 chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu với độ dài 1413 nucleotide và so sánh với vi rút vắc xin A/California/07/09 chỉ phát hiện sự thay đổi 1 nucleotide trong nhóm 2; 7 nucleotide trong nhóm 5. Kết quả trên cho phép xác định độ tƣơng đồng nucleotide của các nhóm/phân nhóm trên gen NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 với vi rút vắc xin A/California/07/09 đạt từ 99,3% - 99,9% (Hình 3.5).
3.2.2.2 Protein NA
Dịch mã trình tự nucleotide phân đoạn gen NA của 52 chủng A(H1N1)pdm09, sử dụng xây dựng cây gia hệ NA và tiến hành so sánh giữa các vi rút trong nhóm/phân nhóm, phát hiện sự thay đổi (đột biến) axit amin
của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Việt Nam và vi rút vắc xin A/California/07/09, kết quả cho thấy:
Các vi rút tập trung trong các nhóm hoặc phân nhóm đều có độ tƣơng đồng về axit amin từ 99,3% đến 99,9% (nhóm/phân nhóm).
Có một số đột biến đƣợc phát hiện khi so sánh protein NA với vi rút vắc xin A/California/07/09.
Bảng 3.5 Sự thay đổi (đột biến) axit amin trên protein NA
Nhóm/
Phân nhóm
2009 2010 2011 2012 2013
Axit amin thay đổi trong protein NA so với vi rút vắcxin A/California/07/09 2 3 4 N248D 3 3 12 N248D, K84R, G87D, S95N, V106I, V234I 5 5 N248D, V83L,V106I, I122V,V241I, I321V, N369K, N386S, D416N 6B 5 N248D, N44S, N200S,V241I, N369K 6C 10 N248D, N44S, V83A, N200S,V241I, N369K 7A 3 1 1 N248D, G41R, N44S, V106I, V241I, N369K, Q313R 7B 1 1 3 N248D, N44S, V241I, N369K Tổng 6 16 4 2 24 52 chủng vi rút
Các vi rút lƣu hành tại Việt Nam có sự thay đổi (đột biến) so với vi rút vắc xin A/California/07/09 từ 1 axit amin (nhóm 2) đến 9 axit amin (nhóm 5) (Bảng 3.5). Tần suất thay đổi của một số axit amin đƣợc xác định thông qua số lần xuất hiện đột biến tại các nhóm khác nhau.
Bảng 3.6 Tần suất thay đổi (đột biến) trên protein NA Nhóm/
Phân nhóm
Axit amin thay đổi trên protein NA so với vi rút A/California/07/09
Asn-Asp N248D Val-Ile V241I Asn-Lys N369K Asn-Ser N44S Val-Ile V106I Val-Leu V83L Val-Ala V83A His-Tyr H275Y 2 √ 3 √ √ √ 5 √ √ √ √ √ √ 6B √ √ √ √ 6C √ √ √ √ √ 7A √ √ √ √ 7B √ √ √ √ √
Kết quả bảng 3.6 cho thấy: Sự thay đổi từ Asparagine (N) thành Aspartic (D) tại vị trí 248 trên protein NA đƣợc ghi nhận tại toàn bộ các nhóm/phân nhóm trên cây gia hệ và đạt tần suất xuất hiện của sự thay đổi này là 100%. Tiếp theo là sự thay đổi từ Valine (V) thành Isoleusine (I) tại vị trí 241 đƣợc ghi nhận tại 6/7 nhóm/phân nhóm của cây gia hệ (tần suất thay đổi đạt 85,7%), các sự thay đổi của N369K, N44S hoặc V106I xuất hiện trên 3 đến 5 nhóm/phân nhóm của cây gia hệ với tần suất thay đổi ghi nhận từ 42,8% - 71,4%. Ngoài ra sự đa dạng thay đổi tại một vị trí cũng đƣợc ghi nhận tại vị trí 83 trên protein NA khi sự thay đổi V83L, H275Y (nhóm 5) và V83A (phân nhóm 6C) (Bảng 3.5 và 3.6) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.2.3. Đặc điểm di truyền các phân đoạn gen M, NS, PB1 và PB2.
3.2.3.1 Cây gia hệ phân đoạn gen M
Cây gia hệ phân đoạn gen M đƣợc xây dựng bởi 50 chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong tổng số 75 chủng vi rút trong nghiên cứu và một số vi rút lƣu hành trên thế giới trong cùng thời gian, sử dụng chủng gốc vi rút vắc xinA/ California/07/09. Kết quả phân tích cây gia hệ cho thấy gen M của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đƣợc chia thành 6 nhóm trong đó các vi rút trong nghiên cứu đƣợc chia 4 nhóm trên cây gia hệ:
- Nhóm 2: bao gồm toàn bộ 12 vi rút phân lập trong năm 2009 và hầu hết các vi rút phân lập năm 2010 (16/18 vi rút) cùng với một số vi rút lƣu hành tại Thái Lan, Trung Quốc năm 2009-2010 và tại Braxin, Mỹ năm 2011- 2013.
- Nhóm 4: gồm 02 vi rút lƣu hành năm 2010; 03 vi rút lƣu hành năm 2011; 01 vi rút lƣu hành năm 2012 và 03 vi rút lƣu hành năm 2013 cùng với một số vi rút lƣu hành tại Thái Lan, Singapore, Nga, Hy Lạp, Ấn Độ … năm 2010 - 2013.
- Nhóm 5: gồm 03 vi rút lƣu hành năm 2012 cùng các vi rút có mặt tại Thái