2. Nội dung nghiên cứu x
1.2. Tổng quan về acrylamide
1.2.2. Giới thiệu về acrylamide
Acrylamide là hợp chất hóa học có công thức phân tử C3H5NO (Erkekoglu, P., &
Baydar, T., 2014). Acrylamide (acrylic amide, IUPAC có tên là 2-propenamide) là một hợp
chất hữu cơ có khối lượng phân tử thấp (71.08g) bao gồm các nguyên tử carbon (50.69%), hydro (7.09%), nitơ (19.71%), oxy (22.51%) (Kopanska, M. và cộng sự, 2018).
Hình 1.5. Công thức cấu tạo của acrylamide
Ở trạng thái ban đầu, nó được tìm thấy là một chất màu trắng, không mùi và tinh thể, với điểm nóng chảy là 84.5oC và tỷ trọng 1.122g/cm3 ở 30oC. Nhiệt độ sôi của nó bằng 192.6oC dưới áp suất 1 atm (101.3 kPa) (Ericsson S. 2005). Acrylamide, là một hợp chất hữu cơ, dễ phản ứng, có liên kết amide trong cấu trúc liên hợp của nó. Acrylamide có thể bị thủy phân đứt liên kết CO-NH2. Nhóm vinyl có thể phản ứng với amoniac, ure, formaldehyde, amin bậc 2, protein, phosphine (Zyzelewicz D, Nebesny E, Oracz J. 2010). Vì vậy, tính chất của nhóm amide - bị thủy phân trong môi trường kiềm đặc hoặc acid đặc cắt đứt liên kết CO-NH2.
1.2.1. Nguồn gốc và cơ chế hình thành acrylamide
Tháng 4 năm 2002, Cơ quan Quản lý thực phẩm Thuỵ Điển cùng với nhóm nghiên cứu của trường Đại học Stockholm đã tìm ra acrylamide, một độc chất có thể gây ung thư, trong một số thực phẩm được chế biến ở nhiệt độ cao (Tareke, E và cộng sự, 2002) giàu carbohydrate như các sản phẩm chiên và bánh nướng (Studer A, B. I., 2004). Nghiên cứu này đã mở màn cho hàng loạt những nghiên cứu tiếp theo về acrylamide trong thực phẩm vì acrylamide có khả năng gây ung thư con người bởi IARC (Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế) (Gökmen, V., và cộng sự, 2008). Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã cung cấp các phương pháp phân tích, mức độ cho phép tiêu thụ acrylamide an toàn để không gây ảnh hưởng lên hệ thần kinh (FAO/WHO, 2002). Các sản phẩm cà phê trên thế giới, trong đó có Việt Nam, sau khi được rang ở nhiệt độ cao từ 230-240°C trong thời gian từ 5-15 phút đều
13
sinh ra một lượng acrylamide đáng kể (Bagdonaite, K. và cộng sự, 2008; Belitz, H. D. và
cộng sự, 2009). Hàm lượng của acrylamide trong một số thực phẩm và đồ uống được tóm
tắt trong bảng 1.9. (Kopanska, M. và cộng sự, 2018).
Bảng 1.9. Thành phần acrylamide trong một số sản phẩm
Loại thực phẩm Thành phần acrylamide (µg/kg)
Khoai tây chiên 170 – 2287
Các sản phẩm bánh (bánh mì, bánh ngọt) 70 – 430 Ngũ cốc 30 – 1400 Ca cao 170 – 351 Bistcuits/Crackers 30 – 3200 Thịt 30 – 64 Bia 30 – 70 Cà phê 12 – 4300 Nguồn: (Kopanska, M. và cộng sự, 2018). Acrylamide được tạo thành từ phản ứng hoá học giữa acid amin asparagine và đường khử ở nhiệt độ cao trên 120oC (Jagerstad M, Skog K., 2005). Asparagine về nguyên tắc có đủ khả năng chuyển thành acrylamide bằng cách khử trực tiếp nhóm carboxyl và nhóm amin, nhưng phản ứng này chỉ có thể tạo ra được hàm lượng acrylamide thấp (Granvogl và
Schieberle, 2006). Tuy nhiên, asparagine với sự có mặt của đường khử hoặc dicarbonyl có
khả năng tạo ra acrylamide với hàm lượng rất lớn (Stadler và cộng sự, 2004). Cơ chế hình thành acrylamide trong thực phẩm được biểu diễn theo sơ đồ dưới đây:
Hình 1.6. Cơ chế hình thành Acrylamide trong thực phẩm được gia nhiệt (Totani, N., và
14
1.2.3. Tác hại của acrylamide
Acrylamide là một chất có khả năng tiềm ẩn gây ra một số bệnh như
Gây độc thần kinh: Nghiên cứu thực nghiệm về việc rối loạn hệ thần kinh do acrylamide trên chuột (Spencer & Schaumburg, 1974a; LoPachin, 2004).Báo cáo kết luận rằng lượng đưa vào không vượt quá 0.5 – 50 mg acrylamide/kg/ngày là mức an toàn cho hệ thần kinh của con người (Miller & Spencer, 1985). Độc tính thần kinh gây ra từ sự acrylamide có thể dẫn đến nhiều triệu chứng, gồm cảm giác tê cứng chân tay (Exon, J. H., 2006).
Ảnh hưởng đến khả năng sinh sản: Độc tố sinh sản được thí nghiệm ở trên chuột, khi sử dụng ở nồng độ 1.25 – 24mg/kg/ngày trong 4 tuần làm giảm tỉ lệ sinh sản, giảm số lượng tinh trùng ở con đực (Sakamoto & Hashimoto, 1986). Nghiên cứu ở nồng độ cao hơn khoảng 35.5 mg/kg hai lần mỗi tuần cho thấy biểu hiện teo tinh hoàn, giảm trọng lượng tinh hoàn và sự thoái hóa của các tế bào biểu mô của ống tủy (Hashimoto & Tanii, 1985). Sự suy giảm khả năng sinh sản có thể ảnh hưởng số lượng và tốc độ di chuyển của tinh trùng (Burek và
cộng sự, 1980).
Gây bệnh ung thư:Báo cáo của FAO/WHO, 2002 về các nguy cơ tiềm ẩn đối với sức khỏe liên quan đến hấp thụ acrylamide từ thức ăn, đã làm tăng mối lo ngại các nguy cơ khi hàm lượng acrylamide tăng gây ung thư trên con người (WHO, 2002). Bên cạnh đó, Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế của Liên Hợp Quốc năm 1994, acrylamide được phân loại là chất có thể gây ung thư ở người (IARC, 1994). Trên động vật gặm nhấm, hàm lượng acrylamide cao đã cho thấy làm tăng nguy cơ gây các khối u ở hệ thần kinh, tuyến vú, tử cung, khoang miệng, màng bụng và tuyến giáp (Johnson et al., 1986).
1.2.4. Ứng dụng của Acrylamide
Acrylamide trong công nghiệp chủ yếu được tạo thành từ quá trình thủy phân của acrylonitrile. Khác với trong thực phẩm, chúng ta có thể tìm thấy chất này trong khói thuốc lá và một số sản phẩm gia dụng, làm đẹp, công nghiệp và dệt may (Mohammad, R. S, 2012;
Exon, J. H., 2006). Acrylamide có công dụng trong một số ngành công nghiệp sau
(Myagchenkov, V. A., & Kurenkov, V. F. 1991) như làm giấy, xây dựng, khoan dầu, sản
xuất dệt may, sản xuất mỹ phẩm, chế biến thức ăn, sản xuất thuốc nhuộc và chất dính, nhựa, khai thác mỏ, nông nghiệp, bao bì thực phẩm, xử lý nước uống và nước thải…
1.2.5. Các phương pháp làm giảm Acrylamide
Giảm mức độ acrylamide trong các sản phẩm thực phẩm tại nhà và trong các bộ phận công nghiệp không chỉ làm giảm các rủi ro sức khỏe liên quan đến hợp chất này, mà còn đem đến cho con người sự hiểu biết về an toàn thực phẩm. Hạn chế sự hình thành tối đa của acrylamide trong các sản phẩm chiên, các sản phẩm gia nhiệt ở nhiệt độ cao. Các phương
15
pháp như chọn giống, bảo quản ở nhiệt độ môi trường (8°C), chiên trong chân không hoặc ở nhiệt độ dưới 120°C, lên men lactic và ngâm trong acetic acid, citric acid, glycine, muối của hydrocoloid, asparaginase enzyme, vitamin và chất chống oxy hóa có thể giảm thiểu sự hình thành acrylamide trong sản phẩm thực phẩm(May NJ và cộng sự, 2006; Zeng X và
cộng sự, 2009; Belgin Erdoǧdu S và cộng sự; 2007). Sau đây là một số chiến lược để ngăn
chặn sự hình thành acrylamide trong thực phẩm (Khezerolou và cộng sự, 2018).
1.2.5.1. Giảm acrylamide trong nguyên liệu
Do cơ chế hình thành acrylamide, tốt nhất là ngăn chặn sự hình thành acrylamide thông qua việc kiểm soát các nguyên liệu có chứa các tiền chất sinh ra phản ứng này. Do đó, lựa chọn các giống có mức đường khử và asparagine thấp thì có thể là biện pháp hiệu quả nhất. Hơn nữa, điều kiện khí hậu, thời gian thu hoạch, điều kiện bảo quản và loại giống có thể ảnh hưởng đến mức độ của asparagine và đường khử (Friedman M, Levin CE, 2008).
Theo một số tài liệu, nếu đất có mức lưu huỳnh thấp, lượng asparagine được hình thành thấp hơn vì thế lượng acrylamide hình thành sẽ thấp hơn trong giai đoạn sản xuất. Ngoài ra, nếu đất chứa nhiều nitơ, lượng acid amin tự do và protein tăng lên dẫn đến hàm acrylamide được tạo ra trong quá trình chế biến (Park Y và cộng sự, 2005).
Trong quá trình bảo quản, để đảm bảo rằng nhiệt độ bảo quản không dẫn đến sự hình thành đường khử, trong trường hợp như vậy việc lưu trữ ở nhiệt độ phòng để giảm mức độ đường khử. Về mặt này, các nghiên cứu trước đây cũng chỉ ra rằng nhiệt độ cực cao trong mùa hè có thể làm giảm sự hình thành acrylamide. Phân bón có thể có tác động đáng kể đến sự hình thành acrylamide (Friedman M, Levin CE, 2008). Nhiệt độ bảo quản sau khi thu hoạch cũng đóng một vai trò quan trọng đối với nguyên liệu sản xuấtnhiệt độ bảo quản từ 4 - 6°C giúp hạn chế sự tích lũy hàm lượng đường trong sản phẩm sau thu hoạch (Viklund, G. Å. và cộng sự, 2008).
1.2.5.2. Giảm acrylamide bằng cách sử dụng enzyme
L- Asparaginase chuyển đổi asparagine thành amoniac và aspartic acid, do đó làm giảm sự hình thành acrylamide. Phương pháp này hữu ích cho các sản phẩm thực phẩm tuy nhiên nó đắt hơn so với các phương pháp khác. Mặt khác, enzyme glucose oxyase có thể oxy hóa glucose và ngăn chặn sự hình thành acrylamide. Đánh giá tác dụng của enzyme đã xác nhận được sự ức chế các tiền chất hình thành acrylamide (tức là asparagine và đường khử) có thể làm giảm sự hình thành acrylamide trong các sản phẩm thực phẩm (Khezerolou, A., 2018).
Việc sử dụng asparaginase trên các loại sản phẩm khác như, cà phê cũng đã được chứng minh về sự hiệu quả trong khả năng giảm lượng acrylamide sinh ra trong quá trình
16
gia nhiệt (Pedreschi, F. và cộng sự, 2008; Hendriksen, H. V. và cộng sự, 2009; Boegl, 2006; Dria, G. J. và cộng sự, 2007).
Vì thế chúng tôi sử dụng L-Asparaginase để làm giảm hàm lượng acrylamide với sản phẩm cà phê trong các khảo sát sau này.
1.3. Tổng quan về Asparagine
Tên IUPAC: (2S) -2,4-Diamino-4-oxobutanoic acid. Ký hiệu: Mã ba chữ cái – Asn. Mã một chữ cái – N. Trọng lượng phân tử: 132.11792 g / mol. Công thức phân tử: C4H8N2O3. Điểm nóng chảy: 235°C. Độ hòa tan trong nước: 20 g°C; pKa – 2,02; pKb – 8,80. Tên gọi khác: (S) -2-Aminosuccinic acid 4-amide; acid alpha-Aminosuccinamic; L-Aspartic 4- amide acid; (2S) Acid -2-Amino-3-carbamoyl-propanoic
Hình 1.7. Công thức cấu tạo của Asparagine
Asparagine là amino acid đầu tiên được phân lập từ thực vật vào 200 năm trước
(Vauquelin L.N., Robiquet P.J., 1806). Mặc dù hòa tan trong cả acid và kiềm, asparagine chỉ
tan vừa phải trong nước và dễ dàng tạo thành tinh thể monohydrate trắng. Hơn nữa, asparagine có tỷ lệ N: C là 2: 4 nên nó có khả năng để lưu trữ và vận chuyển nitơ trong các sinh vật sống.
Mặc dù ban đầu nó không được coi là thành phần của protein, asparagine đã được chứng minh là có mặt trong hệ thống tiêu hóa enzyme của protein dự trữ ở hạt giống tại Brazil (Damodaran M., 1932) và hiện được biết là có mặt trong hầu hết các protein. Nguồn thực phẩm giàu asparagine là các nguồn dinh dưỡng điển hình phổ biến nhất của amino acid này bao gồm thịt bò, thịt gà, các sản phẩm từ sữa, hải sản và trứng. Đối với những người ăn chay, họ có thể nhận được thêm acid amin này khi tiêu thụ măng tây, đậu nành và ngũ cốc nguyên hạt (Lerouge P. và cộng sự, 1998 ; Bencur P. và cộng sự, 2005).
Asparagine được coi là tiền chất chính của acrylamide trong thực phẩm và hàm lượng của nó đã được xác nhận là tác nhân cho sự hình thành acrylamide (Amrein TM và cộng sự,
2004). Điều này thúc đẩy chúng tôi nghiên cứu về phương giảm hàm lượng acrylamide bằng
cách giảm asparagine bởi L- Asparaginase.
1.4. Tổng quan về L – Asparaginase
Asparaginase (L-Asparagine amidohydrolase EC 3.5.1.1) là một enzyme phân bố rộng rãi trong động vật, thực vật và vi sinh vật (Wriston, 1985). Người ta đã chứng minh rằng Asparaginase xúc tác quá trình chuyển hóa asparagine thành aspartic acid và ammonia bằng cách thủy phân nhóm amide của chuỗi asparagine (Hendriksen, Kornbrust, Ostergaard, &
17
Stringer, 2009). Aspartic acid sau đó sẽ đi vào chu trình acid citric, đóng một vai trò quan
trọng trong chuyển hóa acid amin (Sieciechowicz, Joy, & Ireland, 1988). L-Asparaginase đã được sử dụng như một phương pháp điều trị cho một số loại ung thư, chẳng hạn như bệnh bạch cầu (Bushman, Palmieri, Whinna, & Church, 2000). Asparaginase được tiêm vào máu thủy phân asparagine tự do thành aspartic acid và amoniac, và glutamine thành glutamic acid và amoniac (Friedman, 2003). Theo cách này, sự tăng trưởng của các tế bào ác tính bị ức chế.
L-Asparaginase là một enzyme nội bào thu được từ nhiều loại vi sinh vật: Escherichia coli, Erwinia carotovora, Bacillus sp., Enterobacter aerogenes, Corynebacterium glutamicum, Pseudomonas stutzeri. Đối với việc sử dụng dược phẩm, L-Asparaginase thường được lấy từ Escherichia coli(Pritsa & Kyriakidis, 2001). Tuy nhiên, việc sản xuất enzyme rất phức tạp với năng suất thấp, cho đến nay, không có môi trường nào được thiết lập đặc biệt để sản xuất L-Asparaginase tối ưu từ các vi sinh vật khác nhau. Để tối đa hóa sản xuất enzyme, mỗi sinh vật có điều kiện tối ưu riêng (Kenari, Alemzadeh, & Maghsodi, 2011).
Hầu hết asparaginase khá đặc hiệu cho asparagine, hoạt động tối ưu thường đạt được ở pH 5-7 và 37oC. Tuy nhiên, vì glutamine có cấu trúc tương tự asparagine, một số enzyme cũng có hoạt tính thấp đối với glutamine (Krasnoykina, Borisova, Gervaziev, & Sokolov,
2004). Một nhóm nhỏ enzyme, được gọi là glutaminase-asparaginase, có hoạt động cho cả
asparagine và glutamine nhưng xem glutamine như một chất nền (Roberts, Holcenberg, &
Dolowy, 1972). Ngoài ra còn có một số báo cáo khoảng pH tối ưu của L-Asparaginase là
8.6 (Freisling, H., & Slimani, N. 2015). Hai thành phần L-Asparaginase được phân lập từ
Escherichia coli bằng phương pháp sắc ký cột diethylaminoethyl cellulose. Sự xuất hiện sớm đỉnh I L-asparaginase thể hiện hoạt động tối ưu ở pH 7.5-8.6. Ngược lại, hợp chất L- Asparaginase của đỉnh II thể hiện hoạt động tối ưu ở khoảng 8.5 (Roberts, J., Prager, M. D.,
& Bachynsky, N. 1966). Trong sản xuất thực phẩm, L - Asparaginase được sử dụng để giảm
hàm lượng acrylamide (Gökmen, V. et al., 2015; Xu, F. et al., 2016). Vì vậy trong nghiên cứu của chúng tôi quyết định khảo sát pH từ 5 - 8.6.
1.5. Tổng quan về phương pháp siêu âm
Siêu âm có thể được áp dụng trong phòng thí nghiệm hoặc các quy trình quy mô công nghiệp và nhiều cơ sở công nghiệp đã áp dụng thành công kỹ thuật này trong chế biến, bảo quản và chiết xuất thực phẩm. Các ứng dụng của siêu âm trong chế biến thực phẩm rất rộng rãi và chủ yếu phát sinh từ các tác động vật lý của sóng siêu âm (De Sousa D. P., 2012).
Tần số âm thanh đối với con người bao gồm từ 16 đến 20 kHz, trong khi tần số của sóng siêu âm nằm trong khoảng từ 20 kHz đến 10 MHz. Từ dải tần số lớn này, hai nhóm
18
chính được phân biệt và cả hai đều được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm: siêu âm chẩn đoán và siêu âm công suất. Siêu âm là công suất (W), nằm trong khoảng từ 20 kHz đến 100 kHz (I> 1 W.cm-2). Siêu âm chẩn đoán (còn gọi là siêu âm tần số cao) có dải tần từ 2 đến 10 MHz (I <1 W.cm-2) (Mason và cộng sự, 2005).
Hình 1.8. Bể siêu âm Elma (Đức)
* Nguyên lý sử dụng:
Bể rửa siêu âm sử dụng phổ biến trong phòng thí nghiệm, bệnh viện, trường học, viện nghiên cứu, cửa hàng nữ trang, đồng hồ, nhà xưởng sản xuất linh kiện cơ khí, mạch điện tử....
Theo nguyên lý tần sóng siêu âm xung kích áp suất cao hoặc thấp, tạp ra các bọt khí li ti, các bọt khí này va chạm với nhau làm sạch mẫu một cách hoàn hảo mà con người không thế tự mình vệ sinh, làm sạch theo cách thông thường.
Bể rửa siêu âm tiết kiệm thời gian và chi phí sức lao động con người.
*Thông số kỹ thuật:
Tần số siêu âm (kHz): 37. Công suất tiêu thụ tổng S 300 H(W): 1500. Công suất siêu âm (W): 300. Công suất đỉnh siêu âm tối đa (W): 1200. Công suất gia nhiệt (W): 1200. Kích thước sản phẩm W/D/H (mm): 568/340/321. Kích thước bể W/D/H (mm): 505/300/200. Kích thước giỏ W/D/H (mm): 455/250/115. Dung tích chứa tối đa của bể (lit/gal): 28/7.4. Trọng lượng (kg): 11.0. Vật liệu bể: stainless steel. Vật liệu vỏ: stainless steel. Ống xả: 3/8. Tay cầm bằng nhựa (plastic). Chứng nhận đạt tiêu chuẩn chất lượng.
1.6. Tình hình nghiên cứu trong nước
Mối quan tâm về hàm lượng acrylamide trong các thực phẩm giàu carbohydrate khi gia nhiệt cao ngày càng lớn thúc đẩy các nghiên cứu xung quanh vấn đề này. Điển hình là Trần Văn Cường và cộng sự, 2014 đã khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian gia nhiệt đối với hàm lượng acrylamide sinh ra trong cà phê. Nghiên cứu cho thấy hàm lượng acrylamide thu nhận ở mức 6.53 – 91.36 μg/100g trong điều kiện rang từ 210 – 250°C.
Nguyen Thanh Ngoc và cộng sự năm 2014 đã khảo sát biểu hiện của asparaginase từ
19
pastoris tái tổ hợp chứa asp1 bắt đầu sản xuất asparaginase vào giờ thứ 21 của quá trình nuôi cấy. Lượng asp1tăng đều đặn và đạt đến cao nhất sau 54 giờ nuôi cấy. Nghiên cứu này góp phần tạo điều kiện cho các nghiên cứu về sản xuất asparaginase thương mại cho ngành công nghiệp thực phẩm.
1.7. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Theo Dria, G. J. và cộng sự năm 2007 đã nghiên cứu các phương pháp giảm acrylamide trong hạt cà phê rang. Kết quả cho thấy việc xử lý cà phê arabica với L-Asparaginase bằng phương pháp ngâm trong thời gian từ 1 – 2 giờ, thu được kết quả là hàm lượng acrylamide