2. Nội dung nghiên cứu x
2.6.1.5. Xác định đường khử trong hạt cà phê
Xác định lượng đường khử bằng phương pháp DNS (Nielsen, S. S., 2010).
Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS. Cường độ màu của hợp chất tạo thành sẽ được xác định bằng thiết bị quang phổ UV-Vis và chuyển thành giá trị số. Giá trị cường độ màu của hợp chất tạo thành tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. Dựa vào phương trình đường chuẩn sẽ xác định được hàm lượng đường khử của mẫu thí nghiệm.
Hình 2.9. Phản ứng tạo màu giữa thuốc thử DNS và đường khử
Cách tiến hành: Chuẩn bị hóa chất:
Thuốc thử DNS bao gồm: Nước cất: 60 – 70mL; NaOH rắn: 1,6g; DNS (C7H4N2O7): 1g; Muối natrikali tartrat (KNaC4H4O4.4H2O): 30g.
Khuấy tan hoàn toàn hỗn hợp bằng máy khuấy từ và định mực đến vạch 100mL bằng bình định mức. Thuốc thử được bảo quan trong điều kiện nhiệt độ thấp 2 – 8oC và không ánh sáng (dung dịch dùng tốt trong khoảng 10 – 15 ngày sau khi pha). Dung dịch glucose chuẩn 0.1%. Nước cất.
Chuẩn bị dịch trích ly đường từ cà phê: Mẫu cà phê được nghiền thành bột mịn. Cân 1g mẫu, gói gọn trong giấy lọc và thực hiện trích ly béo bằng phương pháp soxhlet (xem ở mục 2.6.1.3) để giảm hàm lượng chất béo có trong mẫu. Sau quá trình trích ly chất béo đem mẫu sấy khô đến khối lượng không đổi, đem mẫu trích ly bằng cồn 80o có khuấy từ gia nhiệt khoảng 70-80oC bằng thiết bị hồi lưu trong vòng 2h, sau đó lọc dịch bằng giấy lọc để thu được hết dịch đường. Sau đó đuổi hết cồn bằng trích ly cô quay dịch mẫu với tốc độ 90 vòng/phút, nhiệt độ cô quay là 50oC trong khoảng 3 phút, thu dịch trích, xác định thể tích và đo UV-Vis bước sóng 540nm. Tiến hành pha loãng mẫu sao cho độ hấp thụ nằm trong khoảng thích hợp. Đây là dung dịch có thể tạo phức để đo độ hấp thụ.
Tiến hành phản ứng và dựng đường chuẩn glucose
Sử dụng dung dịch glucose chuẩn 0.1%, mẫu và thuốc thử để chuẩn bị dãy ống nghiệm có thành phần như Bảng 2.2. Sau đó, chúng ta tiến hành các bước sau:
36
- Đun sôi cách thủy các ống nghiệm đã được chuẩn bị theo công thức ở Bảng 2.2trong 5 phút; sau đó, làm nguội nhanh các ống nghiệm đến nhiệt độ phòng.
- Lấy khoảng 2-3 mL mẫu trong ống nghiệm cho vào Cuvet; sau đó, đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm bằng thiết bị quang phổ so màu.
- Dựa vào số liệu thu được, vẽ đồ thị thể hiện mối tương quan giữa nồng độ đường khử và độ hấp thu xác định được bằng thiết bị quang phổ so màu.
- Viết phương trình đường chuẩn: A = f(C), xác định hệ số tương quang R.
Bảng 2.2.Thành phần dãy ống nghiệm trong phương pháp quang phổ so màu với thuốc thử DNS
STT ống nghiệm ĐC 1 2 3 4 5 Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3
Dung dịch chuẩn, mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 0 0 Dung dịch mẫu, mL 0 0 0 0 0 0 0.3 0.3 0.3 Nước cất, mL 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2 2.7 2.7 2.7 Thuốc thử DNS, mL 1 1 1 1 1 1 1 1 1 OD540nm Hàm lượng (mg) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 - - - Tính toán kết quả:
Từ phương trình đồ thị đường cong chuẩn tính được X mg/ml đường khử trong dung dịch đường pha lõang.
Nhân với hệ số pha loãng n để được lượng đường trong 1 ml dung dịch gốc. Chọn hệ số pha lõang n sao cho OD nằm trong giới hạn đường chuẩn. Tính hàm lượng đường khử trong nguyên liệu (mg/g) = X∗n∗V
𝑚 (2.6)
V: thể tích dịch đường gốc (ml); m: khối lượng mẫu cân (g); n: là độ pha loãng mẫu.