Chương 2 ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU & THIẾT BỊ
2.3.2. ĐỊNH LƯỢNG GLICLAZID TRONG DỊCH SINH HỌC
Áp dụng phương pháp tạo tủa protein để chiết gliclazid trong huyết tương. Lấy 1 ml huyết tương có chứa mẫu thử hay mẫu chuẩn cho vào ống nghiệm có nút, thêm 1,5 ml acetonitril, lắc xoáy trong 30 giây, để yên 30 phút, sau đó ly tâm 3000 vòng/ phút trong 15 phút. Lấy lớp dịch trong lọc qua màng lọc 0,45 μm.
Dịch lọc này đem phân tích bằng máy HPLC với các điều kiện sau: - Pha động: Acetonitril – Nước (43: 57), pH 3.
- Cột: Purospher RP-18, 5 μm. - Tốc độ dòng: 1,5 ml/ phút. - Thể tích tiêm mẫu: 30 μl. - Bước sóng phát hiện 230 nm.
Thẩm định phương pháp định lượng gliclazid trong huyết tương theo các chỉ tiêu:
Độ chọn lọc
Khảo sát thời gian lưu và phổ đồ trên mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương có chứa chất chuẩn và chế phẩm thử nghiệm với nồng độ gliclazid 1 μg/ ml. Tiêu chuẩn: Trên sắc ký đồ mẫu chuẩn và thử, đỉnh của gliclazid tách rõ so với các đỉnh khác, mẫu trắng không có đỉnh ở vị trí này.
Độ đúng và độ chính xác
Độ đúng và độ chính xác trong ngày được xác định trên 3 nồng độ khác nhau của gliclazid trong huyết tương (0,1 μg/ ml; 1,0 μg/ ml và 4,0 μg/ ml), mỗi nồng
độ thực hiện 6 lần xác định. Độ chính xác liên ngày được thực hiện tương tự nhưng trong 6 ngày khác nhau. Trình bày độ đúng dưới hình thức độ lệch thực nghiệm, trình bày độ chính xác dưới hình thức hệ số phân tán.
Độ tuyến tính
Tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ được xây dựng trên 6 nồng độ khác nhau trong khoảng từ 0,1- 6,0 μg/ ml của gliclazid trong huyết tương. Xác định bằng phương pháp hồi quy tuyến tính.
Giới hạn định lượng
Nồng độ thấp nhất của gliclazid trong huyết tương mà tại đó các kết quả phân tích đạt độ chính xác và độ đúng theo quy định thì được chấp nhận là giới hạn định lượng của phương pháp.
Độ phục hồi
Pha các mẫu gliclazid trong huyết tương ở các nồng độ 0,5 μg/ ml; 1,0 μg/ ml; 4,0 μg/ ml bằng cách thêm một lượng gliclazid biết trước vào trong huyết tương, xử lý các mẫu trong huyết tương và tiến hành chạy sắc ký song song với mẫu gliclazid pha trong acetonitril có cùng nồng độ. So sánh diện tích đỉnh của các mẫu. Độ hồi phục không nhất thiết phải đạt 100% nhưng phải ổn định, đúng và có tính lặp lại.
Độ ổn định
- Độ ổn định sau khi làm lạnh và rã đông: pha các mẫu gliclazid trong huyết
tương ở các nồng độ 0,5 μg/ ml và 4,0 μg/ ml, mỗi nồng độ 3 mẫu. Các mẫu được làm đông lạnh và rã đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Sau khi được rã đông hoàn toàn, mẫu lại được làm đông lạnh trở lại với cùng điều kiện trong 24 giờ. Lập lại thêm 2 chu kỳ nữa và phân tích mẫu sau chu kỳ 3.
- Độ ổn định trong ngày: pha các mẫu gliclazid trong huyết tương ở các nồng
độ 0,5 μg/ ml và 4,0 μg/ ml. Mỗi nồng độ làm 3 mẫu. Các mẫu được rã đông tự nhiên và để ở nhiệt độ phòng. Các mẫu được phân tích mẫu sau 24 giờ. - Độ ổn định cách ngày: pha các mẫu gliclazid trong huyết tương ở các nồng độ
0,5 μg/ ml và 4,0 μg/ ml. Mỗi nồng độ làm 3 mẫu. Các mẫu được bảo quản ở trong cùng điều kiện như điều kiện nghiên cứu. Phân tích mẫu sau 7 ngày, 15 ngày và 30 ngày và so sánh với nồng độ của ngày đầu tiên lưu mẫu.