L ỜI MỞ ĐẦU
1.5.1 Cơ sở lý thuyết của quá trình phân lập vi sinh vật[9]:
Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết.
Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật. Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật đươc tạo ra từ một tế bào ban đầu.
Trong tự nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn tại ở dạng quần thể gồm nhiều loài khác nhau. Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý, lý hoá hoặc sử dụng một loài nào trong thực tiễn thì cần phải đưa chúng về dạng thuần khiết.
Nguyên tắc: Tách rời các tế bào vi sinh vật; nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau.
Phương pháp phân lập vi sinh vật thuần khiết: Với hầu hết các loại mẫu nghiên cứu, quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết gồm các bước cơ bản sau:
19
Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật trên các môi trường phân lập
Phân lập vi sinh vật thuần khiết trên môi trường đặc ở đĩa pêtri.
Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập.
1.5.2.Tiến hành phân lập: Dụng cụ: Que cấy Đĩa petri Đèn cồn Bình tam giác Kính hiển vi Ống nghiệm
Mẫu phân lập: đậu hũ được ủ lên mốc, nghiền nát, hòa tan với nước muối sinh lý.
Môi trường phân lập:
Chọn môi trường PGA (potato glucose agar) để tiến hành phân lập. Quá trình chuẩn bị môi trường được thực hiện như sau: 100 g khoai tây gọt vỏ cho vào bình tam giác, thêm 300ml nước đem hấp trong 1 giờ. Sau đó làm nhuyễn khoai tây rồi bổ sung thêm 1000 ml nước, 20g glucose, 20g agar, nấu tan môi trường rồi hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút ở áp suất 1.2 atm.
Tiến hành:
Đổ khoảng 15-20 ml môi trường đã hấp tiệt trùng và để nguội đến khoảng 40-450C vào đĩa petri
Nung nóng đầu que cấy trên đèn cồn để diệt khuẩn, để nguội rồi dùng đầu que cấy lấy dịch đậu hũ đã lên men tự nhiên thực hiện kỹ thuật cấy ria trên môi trường phân lập đã chuẩn bị sẵn. Thao tác cấy ria cần nhanh, chính xác để tránh sự nhiễm tạp vi sinh vật. Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp theo.
20
Kết quả:
Nhận diện nấm mốc:
Chọn khuẩn lạc mốc hệ sợi đặc trưng, phân lập lại trên môi trường thạch PGA nuôi cấy ở nhiệt độ 28-320C trong 2-3 ngày để kiểm tra độ thuần của giống.
Quan sát hình dạng của sợi nấm, bào tử, cuống bào tử dưới kính hiển vi và so sánh với dạng chủng thuần khiết.
Kiểm tra khả năng sinh enzyme protease.
Tiến hành phân lập tách nấm mốc:
Dùng que cấy lấy một ít sợi nấm, gõ nhẹ trên thành đĩa pêtri cho bào tử nấm rơi xuống, đem ủ và kiểm tra độ thuần khiết của giống
Kết quả thu được là sau khi quan sát nhận thấy xuất hiện nấm mốc có bề mặt và màu sắc đồng đều, quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính x10, x40 cho hình dạng của loài cần phân lập, không nhiễm tạp loài vi sinh vật khác, chứng tỏ giống phân lập đã thuần khiết, có thể đem sản xuất bào tử giống.