L ỜI MỞ ĐẦU
1.4 Tổng quan về vi sinh vật trong sản xuất chao:
Trong phương pháp truyền thống, các nhà sản xuất thường tận dụng nguồn vi sinh vật có sẵn trong tự nhiên, khối đậu hũ thường được phơi 2
17
ngày ở điều kiện tự nhiên để vi sinh vật bám vào, gọi là quá trình lên meo. Thế nhưng với cách làm này thì bánh chao dễ bị tạp nhiễm nên hiệu quả không cao, làm giảm năng suất sản xuất sản phẩm
Các loài vi sinh vật thường thấy trên chao là loài nấm mốc
Actinomucor elegan, Mucor hiemalis, Mucor silvaticus, Mucor subtilis.Bên cạnh đó, người ta còn thấy nhiều vi khuẩn tổng hợp protease cũng có mặt ở các mẫu chao.
Tuy nhiên, các nghiên cứu về chao cho thấy loài nấm mốc tốt nhất cho quá trình sản xuất chao là loài nấm mốc Actinomucor elegan và việc sử dụng các giống nấm mốc và vi khuẩn thuần chủng bao giờ cũng cho kết quả cao nhất.
1.4.2. Một số đặc điểm của nấm mốc Actinomucor elegan:
Actinomucor elegan là một loài nấm vi thể thuộc họ Mucoraceae, bộ
Mucorals, lớp zygomycetes, cho khuẩn ty phát triển và phân nhánh. Tế bào nấm chứa đầy đủ các thành phần như ti thể, nhân, hạt lipid, mạng nội mạc.
Hình 1.8: Nấm mốc Hình 1.9: Túi bào tử và bào tử
Actinomucor elegan Actinomucor elegan
Trong sản xuất chao, cần nuôi cấy nấm mốc Actinomucor elegan để thu được nhiều bào tử làm mốc giống. Các điều kiện nuôi cấy mốc có thể tóm tắt như sau:
Độ ẩm: độ ẩm của môi trường tốt nhất cho sự hình thành enzyme nấm mốc là 90-95%. Độ ẩm môi trường thích hợp cho sự hình thành bào tử là 70-72%.
18
Độ ẩm tương đối của không khí từ 80% trở lên đến bão hòa đều thích hợp cho sự phát triển của nấm mốc. Do đó, trong phòng nuôi cần giữ cho độ ẩm không khí bão hòa để tránh cho môi trường khỏi khô.
Actinomucor elegan là vi sinh vật hiếu khí, chỉ phát triển bình thường khi có đầy đủ oxy, nên trong quá trình nuôi cần cung cấp đầy đủ oxy để thỏa mãn sự hô hấp của mốc.
Nhiệt độ phát triển tối ưu của Actinomucor elegan là ở 25-300C. Thời gian: nếu nuôi mốc đúng kỹ thuật thì sau 36-42 giờ, mốc sẽ có hoạt lực thủy phân cao nhất là 2.8-3.5 đơn vị protease.
pH thích hợp cho quá trình nuôi mốc là 5.5-6.5. Các môi trường tự nhiên như cám, đậu, ngô thường có sẵn pH ở khoảng này nên không cần điều chỉnh
1.5. Quá trình phân lập nấm mốc:
1.5.1 Cơ sở lý thuyết của quá trình phân lập vi sinh vật[9]:
Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết.
Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật. Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật đươc tạo ra từ một tế bào ban đầu.
Trong tự nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường tồn tại ở dạng quần thể gồm nhiều loài khác nhau. Muốn nghiên cứu về hình thái, sinh lý, lý hoá hoặc sử dụng một loài nào trong thực tiễn thì cần phải đưa chúng về dạng thuần khiết.
Nguyên tắc: Tách rời các tế bào vi sinh vật; nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau.
Phương pháp phân lập vi sinh vật thuần khiết: Với hầu hết các loại mẫu nghiên cứu, quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết gồm các bước cơ bản sau:
19
Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật trên các môi trường phân lập
Phân lập vi sinh vật thuần khiết trên môi trường đặc ở đĩa pêtri.
Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lập.
1.5.2.Tiến hành phân lập: Dụng cụ: Que cấy Đĩa petri Đèn cồn Bình tam giác Kính hiển vi Ống nghiệm
Mẫu phân lập: đậu hũ được ủ lên mốc, nghiền nát, hòa tan với nước muối sinh lý.
Môi trường phân lập:
Chọn môi trường PGA (potato glucose agar) để tiến hành phân lập. Quá trình chuẩn bị môi trường được thực hiện như sau: 100 g khoai tây gọt vỏ cho vào bình tam giác, thêm 300ml nước đem hấp trong 1 giờ. Sau đó làm nhuyễn khoai tây rồi bổ sung thêm 1000 ml nước, 20g glucose, 20g agar, nấu tan môi trường rồi hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút ở áp suất 1.2 atm.
Tiến hành:
Đổ khoảng 15-20 ml môi trường đã hấp tiệt trùng và để nguội đến khoảng 40-450C vào đĩa petri
Nung nóng đầu que cấy trên đèn cồn để diệt khuẩn, để nguội rồi dùng đầu que cấy lấy dịch đậu hũ đã lên men tự nhiên thực hiện kỹ thuật cấy ria trên môi trường phân lập đã chuẩn bị sẵn. Thao tác cấy ria cần nhanh, chính xác để tránh sự nhiễm tạp vi sinh vật. Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp theo.
20
Kết quả:
Nhận diện nấm mốc:
Chọn khuẩn lạc mốc hệ sợi đặc trưng, phân lập lại trên môi trường thạch PGA nuôi cấy ở nhiệt độ 28-320C trong 2-3 ngày để kiểm tra độ thuần của giống.
Quan sát hình dạng của sợi nấm, bào tử, cuống bào tử dưới kính hiển vi và so sánh với dạng chủng thuần khiết.
Kiểm tra khả năng sinh enzyme protease.
Tiến hành phân lập tách nấm mốc:
Dùng que cấy lấy một ít sợi nấm, gõ nhẹ trên thành đĩa pêtri cho bào tử nấm rơi xuống, đem ủ và kiểm tra độ thuần khiết của giống
Kết quả thu được là sau khi quan sát nhận thấy xuất hiện nấm mốc có bề mặt và màu sắc đồng đều, quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính x10, x40 cho hình dạng của loài cần phân lập, không nhiễm tạp loài vi sinh vật khác, chứng tỏ giống phân lập đã thuần khiết, có thể đem sản xuất bào tử giống.
1.5.3 Tiêu chuẩn đối với một chủng mốc Actinomucor elegan để sản xuất chao: sản xuất chao:
Khuẩn ty thể của nấm phải tròn, bóng, có màu trắng hoặc màu hơi vàng chao để sản xuất ra có màu đặc trưng.
Cấu trúc nấm phải dày, chặt, tạo một lớp màng vững chắc trên mặt bánh đậu để giữ được hình dạng ban đầu.
21
CHƯƠNG 2:
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu:2.1.1 Nguyên liệu chính: 2.1.1 Nguyên liệu chính:
Đậu nành để làm đậu hũ là loại đậu nành có chất lượng tốt, được thu mua tại chợ Đầm, thành phố Nha Trang, có các đặc điểm sau:
Tên khoa học: Glycine max merril
Màu sắc: vàng nhạt.
Mùi: thơm tự nhiên của đậu nành, không có mùi mốc
Trạng thái: hạt đồng đều, không có sâu mọt, bề mặt căng bóng, khô.
2.1.2 Nguyên liệu phụ:Giống nấm mốc: Giống nấm mốc:
Ống giống nấm mốc Actinomucor elegan được mua tại Viện Công nghiệp thực phẩm. Địa chỉ: 301 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội.
Bột mì:
Sử dụng bột mì được sản xuất bởi công ty trách nhiệm hữu hạn bột mì Đại Phong. Địa chỉ: lô 15A, Khu công nghiệp Trà Nóc, thành phố Cần Thơ.
Giấm:
Sử dụng Giấm gạo nguyên chất Lisa được sản suất bởi nhà sản xuất Ajinomoto, có độ acid: 4.5%, được bộ y tế chứng nhận an toàn với người tiêu dùng.
Muối ăn:
Sử dụng muối ăn là dạng muối tinh sấy, hạt nhỏ mịn do công ty muối Khánh Hòa sản xuất, trọng lượng 0.5kg, bao bì PE, đạt tiêu chuẩn sau: hàm lượng NaCl 98%, Ca2+ 0.2 %, Mg2+ 0.1 %, SO42- < 0.3 %, tạp chất tan không quá 0.1 %.
22
Rượu:
Sử dụng rượu Bầu Đá do công ty Hưng Bình, An Nhơn, Bình Định sản xuất, có nồng độ rượu: 450
Ớt:
Ớt được thu mua tại chợ Đầm, là loại ớt đỏ còn tươi, sử dụng đảm bảo không ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm.
2.2 Nội dung nghiên cứu:
- Nghiên cứu xác định thời gian nuôi mốc trong sản xuất bột bào tử mốc Actinomucor elegan từ ống giống.
- Nghiên cứu các thông số trong sản xuất bánh đậu:
Nghiên cứu xác định thời gian ngâm đậu.
Nghiên cứu xác định thời điểm gia nhiệt.
Nghiên cứu xác định lượng nước bổ sung vào công đoạn lọc.
Nghiên cứu xác định tỷ lệ dấm bổ sung.
Nghiên cứu xác định lực nén ép.
- Nghiên cứu các thông số trong quá trình lên men chao bổ sung mốc:
Nghiên cứu xác định chế độ xử lý nhiệt.
Nghiên cứu xác định tỷ lệ mốc bổ sung.
Nghiên cứu xác định thời gian lên men.
Nghiên cứu xác định tỷ lệ muối bổ sung.
Nghiên cứu xác định tỷ lệ rượu bổ sung vào dịch áo ngoài.
Nghiên cứu xác định tỷ lệ muối bổ sung vào dịch áo ngoài.
23
2.2.1 Quy trình sản xuất bột bào tử mốc[4]:
Hình 2.1: Quy trình sản xuất bột bào tử mốc
Trộn đều
Phân phối vào bình tam giác
Sấy Rây
Trộn đều với bột mì rang chín Cấy giống
Nuôi mốc giống Hấp
Bào tử giống cho sản xuất Bột mì + bã đậu +
nước
24
Giải thích quy trình:
Đây là quá trình nhân giống từ ống giống, sử dụng trực tiếp cấy vào nguyên liệu sản xuất. Có 2 cách nuôi giống là nuôi trong bình tam giác và nuôi trong hộp nhôm. Ở đây, sản xuất thí nghiệm nên chọn cách nuôi trong bình tam giác
Bột mì, bã đậu, nước:
Là môi trường thích hợp đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng và khả năng đồng hóa các chất dinh dưỡng của nấm mốc.
Trộn đều:
Là quá trình cơ học nhằm khuấy trộn các thành phần trong hỗn hợp để chúng phân bố đều nhau nhằm tạo độ ẩm thích hợp cho sự phát triển của nấm mốc cũng như phân phối đều các chất dinh dưỡng có trong môi trường.
Phân phối vào bình tam giác:
Sau khi trộn đều các thành phần dinh dưỡng được phân phối vào bình tam giác, mỗi bình 60g môi trường nhằm tạo độ thông thoáng, tránh sự lây nhiễm vi sinh vật và giúp dễ dàng quan sát sự phát triển của nấm mốc.
Hấp:
Mục đích: tiêu diệt các vi sinh vật tạp nhiễm có trong môi trường và thủy phân các thành phần dinh dưỡng tạo thành các hợp chất đơn giản dễ dàng hấp thụ và chuyển hóa.
Tiến hành: Hấp ở 1210C ở áp suất 1,2 atm trong 15 phút.
Cấy giống:
Là quá trình cấy bào tử mốc vào môi trường. Trong công đoạn này, bào tử mốc được cấy trực tiếp từ ống giống vào môi trường.
Nuôi mốc giống:
Mục đích của quá trình nuôi mốc giống là tăng số lượng bào tử mốc nhằm đáp ứng đủ lượng bào tử mốc cho quá trình sản xuất.
Số lượng bào tử mốc ổn định bổ sung vào quá trình nuôi mốc chao sau này là 106 CFU/g.
25
Hình 2.2: Nuôi mốc trong bình tam giác Trộn đều với bột mì rang chín:
Nhằm hòa quyện bào tử mốc vào bột mì rang chín, tạo một lượng giống lớn cho khâu giống trong sản xuất.
Rây:
Mốc bào tử sau khi hòa với bột mì sẽ được đem rây để loại bỏ các phân tử có kích thước lớn.
Sấy:
Nhằm mục đích kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm. Sấy ở nhiệt độ 400C trong 4 giờ.
26
2.2.2 Quy trình sản xuất chao dự kiến:
Hình 2.3: Quy trình sản xuất chao dự kiến
Nước Ủ Đóng nắp Cấy mốc Nuôi mốc Vào hũ Nhúng muối Xử lý nhiệt Ép Gia nhiệt Dịch sữa đậu Dịch sữa đậu Lọc Xay ướt Cắt khối Lọc Bánh đậu Kết tủa Ngâm Gia nhiệt Rửa Nước Nước Nước Bã Nước Mốc bào tử DD muối Rượu Muối Ớt 3% Nắp Đậu nành Chao sản phẩm Bã
27
Giải thích quy trình: Đậu nành:
Sử dụng đậu nành thuộc loại to, có màu vàng nhạt, bề mặt căng bóng, không sâu mọt.
Rửa:
Loại bỏ các tạp chất cơ học như đất, đá, rơm rác…lẫn vào nguyên liệu.
Ngâm:
Ngâm nhằm tách vỏ đậu nành một cách dễ dàng nhất, làm yếu liên kết giữa lớp vỏ và hạt. Lượng nước ngâm tối ưu là 2,5 lít nước/ kg đậu nành.
Xay:
Xay là một quá trình cơ học để phá vỡ tế bào, nhằm giải phóng protein, lipid và glucid. Nhờ có nước hòa tan các chất này và chuyển chúng sang dạng huyền phù. Trong công đoạn xay yếu tố ảnh hưởng mạnh nhất là lượng nước cho vào khi xay. Lượng nước bổ sung khi xay phù hợp là 6 lít nước / kg đậu.
Lọc:
Quá trình lọc nhằm loại bỏ những thành phần bã, hợp chất vô cơ, cặn. Dùng vải lọc có kích thước lỗ phù hợp để thu được hiệu quả lọc cao nhất. Sau khi lọc xong ta thu được 2 phần: dịch sữa và bã. Bã được tận dụng làm thức ăn gia súc.
Gia nhiệt:
Gia nhiệt ngay nhằm phá enzyme kháng tripcin và độc tố aflatoxin, diệt vi sinh vật và khử mùi tanh của đậu nành.
Kết tủa:
Sử dụng giấm làm tác nhân đông tụ, sau khi kết tủa hoàn toàn thì chắt gạn nước ở phía trên và cho hoa đậu vào khuôn ép, tiến hành ép định hình.
Cắt khối:
28
Xử lý nhiệt:
Nhằm mục đích diệt khuẩn, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình lên men.
Cấy mốc:
Mốc chao sau khi sản xuất ở dạng bào tử được cấy trực tiếp vào bánh đậu bằng thủ công.
Nuôi mốc:
Sau khi cấy mốc xong thì phải đảm bảo nuôi ở nhiệt độ 28 - 300C, hàm ẩm không khí là 90% ở những giờ đầu. Sau 14 - 16 giờ nuôi mốc, trên bề mặt bánh đậu xuất hiện những khuẩn ty màu trắng phải đưa hàm ẩm lên 95%. Ở những giờ cuối nuôi mốc cần phải làm giảm hàm ẩm xuống để hạn chế sự phát triển của nấm mốc.
Nhúng muối:
Bánh đậu sau khi lên men được đưa vào các hũ sành lớn, bổ sung dung dich muối với thời gian nhúng là 6h, sau đó lấy ra, để khô rồi cho vào hũ.
Vào hũ:
Xếp miếng chao vào hũ, rót dịch áo ngoài với tỷ lệ miếng chao: dịch = 6:4.
Thành phần dịch áo ngoài gồm: rượu, muối, ớt 3% và nước. Sau khi vào hũ, đóng nắp và ủ.
Ủ:
Trong quá trình ủ, các enzyme nấm mốc sẽ thủy phân protein, lipid để tạo ra mùi vị đặc trưng cho sản phẩm.
2.2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
29
2.2.3.1. Nghiên cứu xác định thời gian nuôi mốc trong sản xuất bột bào tử mốc Actinomucor elegan từ ống giống: bột bào tử mốc Actinomucor elegan từ ống giống:
Hình 2.4: Sơ đồ thí nghiệm xác định thời gian nuôi mốc trong sản xuất bột bào tử mốc Actinomucor elegan từ ống giống.
Cách tiến hành:
Dụng cụ:
Que cấy.
bình tam giác.
bông gòn không thấm nước.
Môi trường nuôi cấy: Bã đậu phụ, bột mì và nước.
Hòa trộn 1kg bã đậu phụ với 0.5 kg bột mì và nước sao cho đạt hàm ẩm 70%, kiểm tra môi trường có pH=5.5 nên không cần điều chỉnh.
Cấy giống
Nuôi mốc giống với thời gian (giờ)
Bào tử giống cho sản xuất Bột mì + bã đậu + nước
Ống giống
Đếm số lượng bào tử trong 1g bột
Chọn thời gian nuôi thích hợp
30
Môi trường được phân phối vào bình tam giác, mỗi bình 60g môi trường, đậy nút bông và hấp tiệt trùng môi trường ở nhiệt độ 1210C, áp lực 1,2 atm trong 15 phút. Môi trường hấp xong có màu nâu nhạt, lắc ngay để môi trường có độ tơi xốp giúp mốc phát triển tốt
Để nguội môi trường xuống khoảng 300C rồi dùng que cấy cấy giống. Nuôi ở nhiệt độ môi trường tự nhiên với thời gian như đã bố trí trong hình 2.3
Sau khi nuôi, mốc giống cho vào bột mì rang chín theo tỷ lệ 1:1, dùng tay sạch bóp thật nhỏ môi trường để các bào tử trên khuẩn ty quyện lẫn vào bột, rây lấy bột ta có mốc bột bào tử. Đem sấy ở 400C trong 4 giờ rồi đếm số lượng bào tử có trong bột.