Như đã trình bày trong cơ chế phát sinh mất đoạn gây α-thalassemia, nguyên nhân phát sinh mất đoạn -α4.2 và -α3.7 là do trao đổi chéo giữa hai nhiễm sắc thể tương đồng trong quá trình giảm phân. Trong vùng trình tự bảo thủ có 3 trình tự tương đồng cao được ký hiệu là X, Y, Z trong cụm gen α-globin. Tái tổ hợp tương đồng giữa hai vùng trình tự Z sẽ hình thành một nhiễm sắc thể mất đoạn 3.7 kb (-α3.7) ch còn 1 gen α-globin gây α+-thalassemia. Tương tự, tái tổ hợp tương đồng giữa hai vùng trình tự X tạo thành một nhiễm sắc thể mất đoạn 4.2 kb (-α4.2) gây α+-thalassemia (Hình 2) [31, 60]. Căn cứ vào vị trí xảy ra tái tổ hợp tương đồng là vùng lặp lại X và vùng lặp lại Z, chúng tôi thiết kế 2 cặp mồi để phát hiện hai mất đoạn này. Mồi α2/3.7-F và mồi 3.7-R (HUMHBA4:11514 11494) để phát hiện đoạn đột biến -α3.7 có kích thước 2018 bp. Cặp mồi 4.2-F (HUMHBA4:3064 3084) và 4.2-R (HUMHBA4:8942 8920) khuếch đại đoạn -α4.2 có kích thước 1638 bp. Thành phần và điều kiện cho đoạn -α4.2 và đoạn -α3.7 được trình bày trong Bảng 2.
36
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%. Chúng tôi thu được kết quả như trong Hình 12. Quan sát kết quả trên Hình 12 (A) chúng tôi nhận thấy ch mẫu 32 xuất hiện một băng duy nhất có kích thước kho ảng 2000 bp tương ứng với kích thước theo tính toán lý thuyết của đoạn đột biến -α3.7. Điều này chứng tỏ chúng tôi đã tối ưu thành công điều kiện PCR đơn phát hiện đoạn đột biến -α3.7
.
Hình 12. Kết quả sàng lọc và tối ưu điều kiện phản ứng PCR đơn khuếch đại đoạn
-α3.7 (A) và đoạn -α4.2 (B). Giếng 25 đến 33: các mẫu bệnh phẩm. Giếng M: thang chuẩn ADN-SY 4,6 kb.
Kết quả trên Hình 12 (B) xuất hiện một băng sáng đậm ở mẫu 28 với kích thước khoảng 1600 bp đúng như mong muốn. Chứng tỏ chúng tôi đã sàng lọc được mẫu dương tính và tối ưu thành công phản ứng PCR đơn phát hiện mất đoạn -α4.2
. Như vậy trong giai đoạn này chúng tôi đã tiến hành sàng lọc và tối ưu điều kiện PCR đơn cho 5 đột biến mất đoạn phổ biến nhất trong bệnh α-thalassemia ở khu vực Đông Nam Á gồm 3 mất đoạn 2 gen gây a0-thalassemia (--SEA, --T HAI, --FIL) và 2 mất đoạn một gen gây α+-thalassemia (-α3.7 và -α4.2). Chúng tôi phát hiện được
37
mẫu dương tính của 4 mất đoạn gồm --SEA, --T HAI,α3.7
và -α4.2. Đồng thời chúng tôi đã tối ưu thành công điều kiện phát hiện đột biến đơn cho cả 4 mất đoạn này. Tuy nhiên, sàng lọc trên 100 bệnh nhân chúng tôi không phát hiện được mẫu nào mang đột biến mất đoạn --FIL
.