Sau khi sàng lọc khuẩn lạc tách dòng, chúng tôi thu được 3 khuẩn lạc mang đoạn chèn 4.2 và 1 khuẩn lạc mang đoạn chèn SEA. Bốn 4 khuẩn lạc này được nuôi bão hòa qua đêm để tách plasmid làm nguyên liệu cho quá trình giải trình tự. Plasmid tách chiết từ 4 khuẩn lạc được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả điện di kiểm tra trên Hình 17 cho thấy cả 4 mẫu đều cho băng plasmid to đậm và không bị đứt gãy.
Hình 17. Kết quả tách plasmid tái tổ hợp. Giếng K1-K3: plasmid mang đoạn chèn 4.2;
Giếng S9: plasmid mang đoạn chèn SEA; Giếng M: thang chuẩn ADN-SY 4,6 kb.
2,6 kb 3,1 kb
1,6 kb 1,5 kb
41
Chúng tôi chọn plasmid của khuẩn lạc K1 và S9 để xác định trình tự với mồi M13R, kết quả được trình bày trong Phụ lục 1 và Phụ lục 2. So sánh trình tự đoạn SEA với ngân hàng dữ liệu NCBI, chúng tôi nhận thấy đoạn trình tự này tương đồng 98 % so với trình tự trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể 16 (16p13.3) từ nucleotide 701 đến 934. Tương ứng với 238 nucleotide trùng lặp với vùng trình tự trên cụm gen
α-globin gồm cả phần trình tự mồi SEA-F. Kết quả so sánh trình tự với ngân hàng dữ liệu một lần nữa khẳng định đoạn SEA khuếch đại là chính xác. Kết quả được trình bày trên Hình 18.
Hình 18. Kết quả so sánh đoạn SEA với ngân hàng dữ liệu NCBI. Query: Trình tự đoạn SEA; Sbjct: Trình tự đoạn gen α-globin của người; Identities: độ tương đồng tính theo tỷ lệ % các nucleotide giống nhau trên tổng số nucleotide được so sánh.
42
Kết quả giải trình tự plasmid mang đoạn chèn 4.2 với mồi M13-R chúng tôi đọc được đoạn trình tự dài 469 bp gồm cả trình tự mồi 4.2-F. So sánh đoạn trình tự này với ngân hàng dữ liệu NCBI cho thấy đoạn trình tự này tương đồng 99 % với vùng trình tự 16p13.3 trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể 16 (Hình 19). Kết quả so sánh trình tự với ngân hàng dữ liệu một lần nữa khẳng định đoạn 4.2 khuếch đại là chính xác.
Hình 19. Kết quả so sánh đoạn 4.2 với ngân hàng dữ liệu NCBI. Query: Trình tự
đoạn 4.2; Sbjct: Trình tự đoạn gen α-globin của người; Identities: độ tương đồng tính theo tỷ lệ % các nucleotide giống nhau trên tổng số nucleotide được so sánh.
43