1.3. PHƯƠNG PHÁP P CR ĐA MỒI TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ALP HA THALASSEMIA THALASSEMIA
Như đã đề cập, hầu hết đột biến trong bệnh α-thalassemia là các mất đoạn trên gen α-globin. Những đột biến này có thể được phát hiện bằng phương pháp PCR sử dụng hai mồi thiết kế dựa vào trình tự ở hai vùng biên đoạn đứt gãy. Với những đột biến mất đoạn lớn, mồi thiết kế ở hai vùng biên ch khuếch đại được alen mất đoạn mà không thể khuếch đại alen bình thường bởi vì khoảng cách giữa hai mồi quá lớn. Kỹ thuật này được gọi là PCR khoảng cách hay "gap PCR".
Theo các nghiên cứu công bố, cho đến nay đã xác định được hơn 35 đột biến mất đoạn phổ biến trên vùng gen α-globin trong đó có hơn 20 mất đoạn lớn (mất đoạn 2 gen), 15 đột biến mất đoạn nhỏ (mất đoạn 1 gen) [34, 44]. Kỹ thuật gap PCR đơn mồi ch xác định từng mất đoạn đơn lẻ, nên không phù hợp với xét nghiệm thường quy phục vụ cho chẩn đoán bệnh. Bởi vì số lượng quy trình xét nghiệm nhiều đồng nghĩa với tăng nhân lực và tăng nguy cơ sai sót do phải thao tác nhiều; bên cạnh đó là việc tăng giá thành xét nghiệm do tiêu hao nhiều vật tư, sinh phẩm. Cho nên, cần thiết phải xây dựng quy trình có thể xác định đồng thời nhiều đột biến. PCR đa mồi (multiplex PCR) là giải pháp ưu việt cho việc phát hiện đồng thời nhiều đột biến mất đoạn trong bệnh α-thalassemia. Đây là dạng cải tiến của gap PCR khi kết hợp nhiều cặp mồi riêng biệt trong cùng một phản ứng. Từ năm 2000 nhóm nghiên cứu của Chong đã công bố kết quả tối ưu thành công quy trình phát hiện đồng thời 5 đột biến mất đoạn phổ biến trong khu vực Đông Nam Á [5]. Các nghiên cứu tiếp theo không những phát hiện được đồng thời nhiều mất đoạn hơn mà còn xác định được cả tình trạng lặp gen (αααanti 3.7
và αααanti 4.2) trong cùng một phản ứng PCR [43]. Trong khi đó, ở Việt Nam hiện tại ch có 4 t nh thành
20
(Hà Nội, HCM, TT Huế, Bến Tre) thực hiện xét nghiệm gen phục vụ chẩn đoán bệnh thalassemia [1]. Vì vậy xây dựng quy trình xác định đồng thời nhiều đột biến gen thalassemia được chúng tôi quan tâm nghiên cứu trong đề tài “Xác định đột biến gen alpha globin gây bệnh Thalassemia bằng kỹ thuật gap PCR đa mồi”
với mục đích (1) thiết kế thành công các cặp mồi phát hiện đột biến; (2) tối ưu hóa được điều kiện PCR cho từng cặp mồi; (3) tối ưu hóa được điều kiện PCR đa mồi; (4) sử dụng điều kiện tối ưu phân tích trên mẫu bệnh phẩm; (5) bước đầu đánh giá tỷ lệ các đột biến mất đoạn trên nhóm bệnh nhân nghiên cứu.
22
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU