Sử dụng kit tách ADN tổng số ReliaprepT M Blood gDNA MiniPrep System (Promega), chúng tôi thu được ADN từ mẫu máu ngoại vi. Nhằm đảm bảo và kiểm soát chất lượng nghiên cứu ngay từ giai đoạn đầu, chúng tôi tiến hành điện di ADN tổng số để kiểm tra tính toàn vẹn ADN, đồng thời đo nồng độ và kiểm tra độ tinh sạch của ADN trên máy quang phổ. Hầu hết lượng ADN thu được đều đảm bảo chất lượng cho nghiên cứu phát hiện đột biến di truyền bằng kỹ thuật PCR. Sau đó, chúng tôi tiến hành pha loãng ADN tổng số về cùng một nồng độ là 50 ng/µl. Kết quả điện di ADN tổng số được trình bày trên Hình 8.
Hình 8. Kết quả điện di ADN tổng số trên gel agarose 1%. Giếng 1 đến 6 và giếng 97 đến 100: các mẫu ADN tổng số của bệnh nhân. M thang chuẩn ADN-SY 4,6 kb. Trong nghiên cứu này ngoài các cặp mồi phát hiện đột biến, chúng tôi còn thiết kế thêm cặp mồi LIS và α2. Cặp mồi LIS được thiết kế trên nhiễm sắc thể số 17 khuếch đ ại đoạn sản phẩm có kích thước 2504 bp. Đây là cặp mồi nội kiểm cho phản ứng để kiểm tra chất lượng ADN tách chiết, kiểm tra thao tác và thành phần trong phản ứng PCR. Cặp mồi α2 khuếch đại vùng trình tự chứa gen α2 có kích thước 1836 bp. Cả 5 mất đoạn chúng tôi sàng lọc đều chứa gen α2. Do đó việc sử dụng cặp mồi α2 giúp phân biệt trạng thái đồng hợp hoặc dị hợp tử của đột biến. Thành phần và điều kiện tối ưu của từng cặp mồi đã được trình bày trong Bảng 2.
4,1 kb 4,6 kb
33
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả trên Hình 9 cho thấy hai cặp mồi LIS và cặp mồi α2 đều khuếch đại băng ADN đặc hiệu sáng đậm có kích thước như tính toán lý thuyết lần lượt là 2504 bp và 1836 bp.
Hình 9. Kết quả tối ưu điều kiện PCR khuếch đại đoạn α2 và đoạn nội kiểm LIS. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%. Giếng 1: sản phẩm PCR với cặp mồi α2. Giếng 2: sản phẩm PCR với cặp mồi LIS. Giếng M: ladder 1 kb (affymetrix).