2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- 100 mẫu máu ngoại vi được cung c ấp bởi Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2012
- Mẫu nghiên cứu được lựa chọn dựa trên xét nghiệm phân tích tế bào máu có dấu hiệu nghi ngờ bị thalassemia với một trong trong các ch số như: lượng tế bào hồng cầu giảm, thể tích trung bình hồng cầu giảm (MCV < 80 fl), lượng huyết sắc tố trung bình trong một tế bào hồng cầu giảm (MCH < 27 pg).
2.1.2.Hóa chất
dNTPs (Promega); MgCl2 (Promega);
GoTaq Flexi ADN polymerase (Promega); Proteinase K (20 mg/ml)
Phenol: Chloroform: Isoamyl (25:24:1)
Kit tách chiết ADN tổng số ReliaprepT M Blood gDNA MiniPrep System (Promega)
Kit nhân dòng gen InsTAcloneT M PCR Cloning Kit (Fermentas) Agarose (Takara)
Dòng tế bào khả biến Escherichia coli JM109 cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Các hóa chất thông dụng khác đều đạt độ tinh khiết dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử.
23
2.1.3. Các cặp mồi
Dựa vào các nghiên cứu đã công bố, phân tích các vùng trên cụm gen α- globin phù hợp với thiết kế mồi, chúng tôi thiết kế 5 mồi xuôi và 6 mồi ngược theo sơ đồ mô tả trên Hình 6 cho phép phát hiện đồng thời 5 mất đoạn phổ biến nhất. Mồi xuôi α2/3.7-F là mồi chung khuếch đ ại đoạn đột biến 3.7 và đoạn α2 để kiểm tra tính đồng hợp, dị hợp tử đột biến. Năm cặp mồi phát hiện 5 mất đoạn phổ biến là: --T HAI, --FIL, --SEA, -α3.7 và -α4.2. Ngoài ra chúng tôi còn thiết kế thêm cặp mồi nội kiểm nhân đoạn LIS nằm trên nhiễm sắc thể 17.
Hình 6. Sơ đồ thiết kế mồi phát hiện 5 mất đoạn phổ biến trong bệnh alpha thalassemia [5, 6, 57].
Trình tự, chiều dài mồi và kích thước sản phẩm PCR với mỗi cặp mồi được diễn giải chi tiết trong Bảng 1. Trong đó, cặp mồi α2/3.7-F và α2-R nhân đoạn α2 để kiểm tra tính đồng hợp, dị hợp của đột biến. Các cặp mồi SEA-F/R, THAI-F/R, FIL-F/R, α2/3.7-F/3.7-R, 4.2-F/R dùng trong phản ứng PCR để phát hiện các đột biến tương ứng trên gen α-globin. Cặp mồi M13-F/R để sàng lọc khuẩn lạc trong giai đoạn tách dòng các đoạn đột biến. Các mồi dùng trong nghiên cứu này được cung cấp bởi hãng IDT (Mỹ).
24
Bảng 1. Trình tự các cặp mồi dùng trong nghiên cứu và kích thước sản phẩm PCR tương ứng [5, 6, 57]
Tên mồi Trình tự mồi 5’ – 3’ Sản phẩm
(bp)
LIS1-F GTCGTCACTGGCAGCGTAGATC LIS1 3’UTR
(2504 bp) LIS1-R GATTCCAGGTTGTAGACGGACTGC α2/3.7-F GATGCACCCACTGGACTCCTG -α3.7 (2018 bp) 3.7-R GCATCCTCAAAGCACTCTAGGGTC α2/3.7-F GATGCACCCACTGGACTCCTG α2 (1836 bp) α2-R CAAAGACCAGGAAGGGCCGGT 4.2-F GTTTACCCATGTGGTGCCTCCATG -α4.2 (1638 bp) 4.2-R CTTCTCATTTCCCCTCCCTGTCTG
SEA-F CTCTGTGTTCTCAGTATTGGAGGGAAG --SEA (1336 bp) SEA-R TGTTCCCAAGCCCACGTTGTGTTC
THAI-F GACCATTCCTCAGCGTGGGTG --THAI
(1144 bp)
THAI-R GTAGGTTCTGTACCAAGTGGGCTGA
FIL-F CAGTCTGGGTGACAGAGCAAGAC --FIL
(546 bp) FIL-R ATAACCTTTATCTGCCACATGTAGC
M13-F GTAAAACGACGGCCAGT (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
M13-R CGAGAAACAGCTATGAC
2.1.4. Thiết bị
Các máy móc, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu thuộc Phòng thí nghiệm Sinh Y Khoa Sinh học và Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
25
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Với mục đích xác định đồng thời nhiều đột biến mất đoạn trên gen α-globin, chúng tôi bố trí sơ đồ thí nghiệm như Hình 7 gồm các bước: (1) thu nhận mẫu bệnh phẩm (200 µl máu ngoại vi), (2) tách chiết ADN tổng số bằng kit thương mại. (3) kiểm tra chất lượng ADN bằng phương pháp điện di, xác định nồ ng độ và độ tinh sạch bằng phương pháp đo mật độ quang học; (4) tối ưu hóa điều kiện PCR với cặp mồi nội kiểm LIS và α2 và khuôn là ADN đạt chất lượng (5) tách dòng và giải trình tự vùng đột biến của mẫu ADN cho kết quả dương tính. (6) tối ưu hóa điều kiện cho phản ứng PCR đa mồi. Tham khảo các tài liệu về tối ưu hóa phản ứng PCR đa mồi nói chung và những nghiên cứu PCR đa mồi trong mất đoạn alpha thalassemia, c húng tôi tập trung vào 3 vấn đề trọng tâm: thứ nhất là tối ưu hóa theo dải nhiệt độ gắn mồi; thứ hai là tối ưu hóa theo t ỷ lệ nồng độ các mồi; thứ ba là sử dụng thêm một số chất tăng cường phản ứng để hỗ trợ cho việc khuếch đại nhiều trình tự đích. (7) Áp dụng điều kiện tối ưu cho PCR đa mồi để xác định đột biến cho các mẫu bệnh phẩm. (8) thống kê phân tích số liệu nghiên cứu.
26
Hình 7. Sơ đồ nghiên cứu. (1) thu thập mẫu bệnh phẩm; (2) tách chiết ADN; (3) kiểm tra chất lượng và nồng độ ADN; (4) tối ưu hóa PCR cho cặp mồi đơn; (5) tách dòng đoạn mang đột biến; (6) tối ưu hóa PCR đa mồi; (7) sàng lọc trên mẫu bệnh phẩm; (8) phân tích số liệu nghiên cứu.
27
2.2.2. Phương pháp xác định nồng độ ADN bằng đo quang phổ
Để kiểm tra chất lượng và xác định nồng độ ADN, trong nghiên cứu này chúng tôi kết hợp phương pháp điện di và đo quang phổ. Phương pháp điện di nhằm kiểm tra mức độ đứt gãy ADN, còn phương pháp đo quang phổ để xác định nồng độ và độ sạch của ADN (1,8 < A260/A280 < 2). Phương pháp này dựa trên nguyên lý hấp phụ ánh sáng cực đại của ADN tại bước sóng 260 nm. Nồng độ ADN được tính theo công thức sau:
[ADN] = Α260 x n x 50 (µg/ml) Trong đó: Α260 là độ hấp thụ của ADN ở bước sóng 260 nm
n là số lần pha loãng mẫu
50 là nồng độ ADN ứng với Α260 = 1 A260/A280 thể hiện độ sạch ADN.
2.2.3. Kỹ thuật PCR đa mồi
Trong nghiên c ứu này, phản ứng PCR được sử dụng để khuếch đ ại các đoạn nội kiểm, đoạn mang đột biến và kiểm tra vector mang đoạn chèn sau khi tách dòng. Phản ứng PCR đa mồi khuếch đại được đồng thời 5 đoạn có kích thước khác nhau: 1 đoạn nội kiểm LIS, 1 đoạn xác định đồng hợp/dị hợp tự gen α2-globin, 3 mất đoạn phổ biến nhất gồm --SEA, -α3.7 và -α4.2. Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại các cặp mồi đơn được trình bày trên Bảng 2. Trong đó, nhiệt độ gắn mồi cho các đoạn LIS, a2, SEA, THAI, FIL, α3.7, α4.2 lần lượt là 62, 63, 64, 60, 60, 65 và 64o
C. Thời gian gắn mồi cho các cặp mồi khuếch đại các đoạn này lần lượt là 1 phút, 1 phút, 1 phút 30 giây, 30 giây, 30 giây, 2 phút 30 giây và 2 phút 30 giây.
28
Bảng 2: Thành phần và điều kiện phản ứng khuếch đại các cặp mồi đơn
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện H2O đủ 15 μl Biến tính lần đầu: 940 C trong 3 phút Lặp lại 45 chu kỳ: Biến tính : 940 C trong 30" Gắn mồi : 600 C - 650C trong 30” - 2' 30" (tùy thuộc vào từng cặp mồi)
Tổng hợp: 720
C trong 2’ 30”
Tổng hợp bước cuối: 720C trong 5 phút
Đệm 10x 1,5
MgCl2 25 mM 1,2
dNTP 2 mM 0,5 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mồi xuôi 10 nM 0,5
Mồi ngược 10 nM 0,5
GoTaq ADN polymerase 5 u/ µl 0,2
ADN khuôn 20-200 ng
Tổng thể tích 15,0
2.2.4. Phương pháp đi ện di
Điện di là phương pháp phổ biến để phân tách các phân tử axit nucleic. Dưới tác dụng của điện trường một chiều, ADN sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương nhờ có nhóm phosphat tích điện âm. Các phân tử ADN được phân tách dựa vào kích thước và cấu hình phân tử ADN trên giá thể gel agarose. Quá trình phân tách ADN được thực hiện trong đệm TBE 1X (Tris base, Axit boric, EDTA). Các băng ADN được phát hiện dưới tia tử ngoại sau khi nhuộm với ethidium bromide . Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng gel agarose 1% để phân tách các đoạn sản phẩm có kích thước từ 1000 bp đến 2500 bp.
2.2.5. Phương pháp tách dòng
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) sau đó đưa vào vector pTZ57R/T theo quy trình của InsTAcloneT M
PCR Cloning Kit (Fermentas).
29
2.2.5.1. Biến nạp bằng sốc nhiệt
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp sốc nhiệt để biến nạp các vector tái tổ hợp vào tế bào E. coli JM109. Các tế bào vi khuẩn được xử lý với CaCl2 có màng trở nên xốp, tạo điều kiện cho ADN plasmid đi qua các lỗ trên màng khi nhiệt độ thay đổi đột ngột. Quy trình thực hiện gồm các bước cơ bản sau:
Lấy tế bào khả biến E. coli JM 109 từ -80oC, để trên đá 5 phút Bổ sung 5 µl hỗn hợp của phản ứng nối, búng nhẹ, ủ trên đá 30 phút Sốc nhiệt hỗn hợp ở 42oC trong 45 giây, để lại trên đá 3 phút
Bổ sung 1 ml môi trường LB, ủ 37oC trong 15 phút, lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 1 giờ
Ly tâm hỗn hợp ở nhiệt độ phòng, 3000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ 900 µl dịch phía trên
Chuẩn bị đĩa thạch LB có bổ sung Ampicillin (50 µg/ml), X-gal (40 µg/ml) và 40 µl IPTG 100 mM, đặt đĩa LB trong tủ ấm 370
C trong vòng 30 phút
Hoà tan phần tủa bằng 100 µl dung dịch còn lại và trải trên đĩa thạch LB đã chuẩn bị ở trên.
2.2.5.2. Sàng lọc khuẩn lạc và nuôi tế bào bão hòa
Mỗi khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch LB bổ sung ampicillin được sàng lọc nhanh bằng kĩ thuật PCR. Khuẩn lạc cho băng ADN có kích thước phù hợp sẽ được sàng lọc tiếp bằng cách nuôi bão hòa qua đêm trong môi trường LB bổ sung ampicillin (50 µg/ml) lắc 200 vòng/phút ở 370C qua đêm, tách plasmid và cắt kiểm tra với enzyme giới hạn.
30
2.2.5.3. Tách plasmid
ADN plasmid được tách chiết theo quy trình trong Molecular Cloning – A Laboratory Manual gồm các bước như sau.
Ly tâm thu cặn tế bào, 6,000 vòng/phút ở 40C trong 5 phút
Hòa tan cặn tế bào trong 100 µl dung dịch I (Tris-HCl 25 mM pH 8, glucose 50 mM, EDTA 10 mM pH 8) có bổ sung RNase 20 µg/ml, ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng
Thêm 200 µl dung dịch II (NaOH 0,2 N, SDS 1%), trộn nhẹ, ủ trên đá trong 3 phút
Thêm 150 µl dung dịch III (CH3COOK 3M pH 5,2), trộn nhẹ, ủ trên đá trong 5 phút (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ly tâm 13,000 vòng/phút ở 40C trong 15 phút để thu dịch trong
Bổ sung 1 thể tích Phenol : Chloroform : Isoamyl (25 : 24 : 1), trộn nhẹ Ly tâm 13,0 00 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, thu dịch pha
trên
Bổ sung 0,6 thể tích isopropanol, ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Ly tâm 13,000 vòng/phút ở 40C trong 20 phút, thu tủa
Rửa tủa bằng 500 µl ethanol 70%, ly tâm 13,000 vòng/phút ở 40C trong 5 phút, thu tủa và làm khô tủa
Hòa tủa trong 30µl H2O, bảo quản ở -200 C.
31
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. ĐẶC ĐIỂM NHÓM BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 100 mẫu bệnh phẩm được cung c ấp bởi Viện Huyết học & Truyền máu Trung ương. Các bệnh phẩm này được thu thập từ những bệnh nhân đến khám và điều trị tại Trung tâm Thalassemia trực thuộc Viện. Hầu hết số bệnh nhân nghiên cứu được sàng lọc dựa trên phân tích công thức máu ngoại vi và phân tích thành phần huyết sắc tố (Phụ lục 4).
Về đặc điểm công thức máu ngoại vi, người Việt Nam số lượng hồng cầu ở nam và nữ lần lượt trong khoảng 3,87 - 4,91 1012/l và 4,18 - 5,42 1012/l; lượng hemoglobin trong khoảng 117,5 - 143,9 g/l ở nam và 132,0 - 153,6 g/l ở nữ. Kết quả phân tích tế bào máu ngo ại vi trong P hụ lục 3 có 98/100 bệnh nhân có biểu hiện thiếu máu, tức là số lượng hồng cầu ho ặc/và lượng hemoglobin thấp hơn bình thường. Phân tích máu ngoại vi có hai ch số quan trọng nhất để chẩn đoán thalassemia là thể tích hồng cầu trung bình (MCV) và lượng huyết sắc tố trung bình trong một hồng cầu (MCH). Các trường hợp nghi ngờ thalassemia khi thể tích hồng cầu nhỏ (MCV < 80 fl) ho ặc hồng cầu nhược sắc (MCH < 27 pg). Theo số liệu trong Phụ lục 4 có 91/100 bệnh nhân nghi ngờ thalassemia hay ch số MCV < 80 fl hoặc/và MCH < 27 pg. Cụ thể có 89/100 trường hợp có hồng cầu nhược sắc, 68/100 trường hợp hồng cầu nhỏ MCV < 80 fl và 66/100 trường hợp có hồng cầu nhỏ, nhược sắc (MCH < 27 pg và MCV < 80 fl).
Đặc điểm về thành phần và tỷ lệ huyết sắc tố có vai trò quan trọng trong phân loại bệnh thalassemia. Những bệnh nhân thalassemia thường có sự dao động
của một số phân tử huyết sắc tố điển hình và sự xuất hiện các huyết sắc tố bất thường khác. Đáng chú ý trong đó là t ỷ lệ huyết sắc tố HbΑ2. người trưởng
thành, giá trị bình thường của HbA2 trong kho ảng 2,0 - 3,2 %, ở những bệnh nhân β-thalassemia HbΑ2 thường lớn hơn 3,5 % và giảm nhẹ ở những bệnh nhân α-
32
thalassmia. Tỷ lệ HbA2 < 3,2 % thường được nghi ngờ đến α-thalassemia. Tuy nhiên tỷ lệ này ch phân biệt được bệnh HbH với tỷ lệ HbA2 luôn nhỏ hơn 2 %.
3.2. KẾT QUẢ SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN ĐƠN
Sử dụng kit tách ADN tổng số ReliaprepT M Blood gDNA MiniPrep System (Promega), chúng tôi thu được ADN từ mẫu máu ngoại vi. Nhằm đảm bảo và kiểm soát chất lượng nghiên cứu ngay từ giai đoạn đầu, chúng tôi tiến hành điện di ADN tổng số để kiểm tra tính toàn vẹn ADN, đồng thời đo nồng độ và kiểm tra độ tinh sạch của ADN trên máy quang phổ. Hầu hết lượng ADN thu được đều đảm bảo chất lượng cho nghiên cứu phát hiện đột biến di truyền bằng kỹ thuật PCR. Sau đó, chúng tôi tiến hành pha loãng ADN tổng số về cùng một nồng độ là 50 ng/µl. Kết quả điện di ADN tổng số được trình bày trên Hình 8.
Hình 8. Kết quả điện di ADN tổng số trên gel agarose 1%. Giếng 1 đến 6 và giếng 97 đến 100: các mẫu ADN tổng số của bệnh nhân. M thang chuẩn ADN-SY 4,6 kb. Trong nghiên cứu này ngoài các cặp mồi phát hiện đột biến, chúng tôi còn thiết kế thêm cặp mồi LIS và α2. Cặp mồi LIS được thiết kế trên nhiễm sắc thể số 17 khuếch đ ại đoạn sản phẩm có kích thước 2504 bp. Đây là cặp mồi nội kiểm cho phản ứng để kiểm tra chất lượng ADN tách chiết, kiểm tra thao tác và thành phần trong phản ứng PCR. Cặp mồi α2 khuếch đại vùng trình tự chứa gen α2 có kích thước 1836 bp. Cả 5 mất đoạn chúng tôi sàng lọc đều chứa gen α2. Do đó việc sử dụng cặp mồi α2 giúp phân biệt trạng thái đồng hợp hoặc dị hợp tử của đột biến. Thành phần và điều kiện tối ưu của từng cặp mồi đã được trình bày trong Bảng 2.
4,1 kb 4,6 kb
33
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả trên Hình 9 cho thấy hai cặp mồi LIS và cặp mồi α2 đều khuếch đại băng ADN đặc hiệu sáng đậm có kích thước như tính toán lý thuyết lần lượt là 2504 bp và 1836 bp.
Hình 9. Kết quả tối ưu điều kiện PCR khuếch đại đoạn α2 và đoạn nội kiểm LIS. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%. Giếng 1: sản phẩm PCR với cặp mồi α2. Giếng 2: sản phẩm PCR với cặp mồi LIS. Giếng M: ladder 1 kb (affymetrix).
3.2.1. Sàng lọc mất đoạn SEA
Những nghiên cứu về bệnh α-thalassemia trong khu vực Đông Nam Á cho thấy mất đoạn --SEA là phổ biến nhất có tỷ lệ trên 70 % [19]. Nguyên nhân phát sinh mất đoạn --SEA được giả thiết là do hai trình tự lặp lại ngược chiều "GGAGGTTC” và “CTTGGAGG” bắt cặp bổ sung tạo cấu trúc thòng lọng gây đứt gãy ADN [47]. Trên cơ sở nghiên cứu này, chúng tôi thiết kế mồi SEA-F (HSGG1:26120 26140) cách trình tự “GGAGGTTC” 162 bp và mồi SEA-R (HSCOS12:3817 3797) cách trình tự “CTTGGAGG” 1178 bp. Sau quá trình sàng lọc mẫu dương tính và nhiều lần thay đổi từng thành phần và từng bước trong chu trình chúng tôi đã