Sản phẩm nối được biến nạp vào chủng vi khuẩn E. coli JM109. Vi khuẩn biến nạp được sàng lọc trên môi trường thạch LB có bổ sung IPTG, X-gal và kháng sinh ampicilin nồng độ 50 μg/ml. Các khuẩn lạc màu trắng được hòa trong 20 μl LB và sàng lọc trực tiếp với cặp mồi vector M13-F/R. Thành phần và điều kiện được trình bày trong Bảng 4.
38
Bảng 4. Thành phần và điều kiện sàng lọc khuẩn lạc với cặp mồi vector M13-F/R
Thành phần Thể tích (µl) Điều kiện
H2O 11,3
Biến tính lần đầu: 940C trong 3 phút Lặp lại 45 chu kỳ:
+ Biến tính : 940C trong 30 giây + Gắn mồi : 620C trong 20 giây + Tổng hợp: 720 C trong 15 giây Tổng hợp bước cuối: 720C trong 5 phút Đệm 10X (15 mM Mg2+) 1,5
dNTP 2 mM mỗi loại 0,5
M13-F 10 nM 0,25
M13-R 10 nM 0,25
JumpStart Taq ADN
polymerase 2,5 u/µl 0,2 Khuẩn lạc hòa trong LB 1,0
Tổng thể tích 15,0
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện di trên Hình 13 cho thấy có 7 khuẩn lạc lên băng khoảng 1500 bp. Đây là đoạn ADN gồm khoảng cách giữa hai mồi vector M13 và đoạn đột biến SEA.
Hình 13. Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn SEA bằng cặp mồi vector
M13-F/R. Giếng S1 - S11: khuẩn lạc tái tổ hợp; Giếng M: thang chuẩn ADN-SY 4,6 kb.
Từ 7 khuẩn lạc dương tính với cặp mồi M13-F/R, chúng tôi chọn ra 4 khuẩn lạc S9, S10, S11, S12 để tiếp tục sàng lọc với cặp mồi đoạn chèn SEA-F/R. Kết quả trên Hình 14 cho thấy ch duy nhất khuẩn lạc S9 lên băng có kích thước kho ảng 1,35 kb tương ứng với kích thước đoạn đột biến --SEA. Điều này chứng tỏ chúng tôi đã tách dòng thành công đoạn đột biến --SEA
trong chủng vi khuẩn
E. coli JM109.
1,5 kb 1,5 kb
39
Hình 14. Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn SEA bằng cặp mồi SEA-F/R. Giếng S9, S10, S11, S12: khuẩn lạc tái tổ hợp; Giếng --: đối chứng âm không có ADN; Giếng M: thang chuẩn ADN-SY 4,6 kb.