Sau khi phân tích hình ảnh bản gel 2-DE, những spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư so với mô gan bình thường được cắt và thủy phân, thu được hỗn hợp peptide sử dụng cho phân tích khối phổ. Mỗi protein cho kết quả là một tập hợp dữ liệu về khối lượng của các peptide khác nhau sau khi bị phân cắt bởi enzyme trypsin. Trypsin là một protease thuộc nhóm serine, được sử dụng phổ biến nhất trong phân tích proteomics. Enzyme này phân cắt các protein tại đầu C của lysine và arginine. Thông thường, một protein 50kDa sẽ bị trypsin phân cắt thành 30 đoạn peptide có khối lượng phù hợp để phân tích khối phổ. Một đặc điểm thuận lợi của trypsin đối với phân tích proteomics là enzyme này thể hiện hoạt tính mạnh cả trong dung dịch lẫn khi thuỷ phân trong gel. Bằng kỹ thuật MALDI-TOF MS, chúng tôi đã xác định được các peptide trong mẫu thủy phân protein và biểu thị bằng các đỉnh trên đồ thị (hình 10). Với mỗi đỉnh trên đồ thị, trục hoành biểu diễn khối lượng/điện tích của peptide (M/Z) và trục tung biểu thị độ lớn của tín hiệu tương ứng peptide đó khi phân tích khối phổ (đơn vị mV).
Hình 10. Phân tích khối phổ các peptide thu được sau khi thủy phân spot protein C-256-B bằng trypsin
42
Protein được nhận dạng theo phương pháp PMF (Peptide mass fingerprint), khối lượng của peptide được tạo ra sau khi thủy phân được so sánh với cơ sở dữ liệu NCBInr, sử dụng phần mềm Mascot thông qua webside www.matrixscience.com [52]. Kết quả nhận dạng là một danh sách các protein và một số thông tin cơ bản như: tên, ký hiệu, khối lượng phân tử, trình tự peptide phù hợp, sai số,… Tuy nhiên, protein tra được phải có score lớn hơn 64 mới có ý nghĩa (độ tin cậy lớn hơn 99,95%). Thông tin chi tiết về protein tra được gồm: tổng giá trị khối đã tra, số giá trị khối phù hợp với giá trị trong trình tự chuẩn và phần trăm phù hợp trong cơ sở dữ liệu. Ngoài ra, phần mềm còn đưa ra trình tự amino acid của protein tra được, phần màu đỏ là trình tự của đoạn peptide phù hợp khi tra với cơ sở dữ liệu. Cuối cùng là sự sai khác về khối lượng của các peptide đã tra cứu với khối lượng đã tính toán biểu thị bằng bảng và đồ thị. Kết quả nhận dạng của spot N97B trên bản gel mẫu mô gan ung thư là ví dụ về nhận dạng protein theo phương pháp PMF (phụ lục 3). Danh sách các protein đã xác định theo phương pháp này được trình bày ở bảng 9.
Bảng 9. Danh sách các protein được xác định bằng MALDI-TOF MS từ bản gel mô gan ung thư so sánh với mô gan đối chứng của bệnh nhân HCC
Spot Tên protein
Yếu tố nhận dạng protein KLPT (Dalton) pI % phù hợp Score Biểu hiện C43C Suppressor of tumorigenicity 7 protein- like (ST7L) Q8TDW4 37.024 8,42 12 73 ↑ C56B Protein disulfide-isomerase A3 (Erp57/ PDIA3) P30101 28.483 5,49 20 71 ↑ C52C Human Mitochondrial Aldehyde Dehydrogenase P05091 54.394 5,7 19 88 ↓ N80A 15 71 ↓ C256B REST corepressor 1
(Protein CoREST) Q9UKL0 47.762 8,23 12 74 ↑
P130B Glutamine synthetase (GS) P15104 42.745 6,43 14 69 ↑
P193B Transcription Factor Ca150 O14776 9.408 9,69 54 85 ↑
P221B Heat shock protein beta-1
(HSPB1/HSP27) P04792 22.826 5,98 24 66 ↓
43
P71B Apolipoprotein L2 Q9BQE5 45.887 8,79 14 74 ↑
P57D MHC class I antigen Q95460 9600 11,26 30 73 ↓ O167B BAT2 protein (Protein
PRRC2A) P48634 17.081 9,94 25 88 ↑
O244B
Bromodomain and PHD finger containing 1 (Protein
Peregrin)
P55201 59.536 8,66 13 71 ↑
O67B Immunoglobulin G heavy
chain variable region AEX28843 13.503 8,62 59 69 ↑
O301B
Mitochondrial 3-oxoacyl- CoA thiolase (3-ketoacyl-
CoA thiolase)
P42765 42.469 8,51 23 69 ↑
O113
A Zinc finger protein AAC50263 28.889 9,6 20 67 −
O137B AP-2 complex subunit
alpha-1 O95782 106.378 7,75 9 89 ↑
O286B Metastasis related protein AAG27483 10.414 5,43 56 84 ↑
O46D Heterogeneous nuclear
ribonucleoprotein L-like Q8WVV9 49.517 9,01 14 66 −
O285B Peroxiredoxin 2 A6NIW5 15.243 5,82 33 68 ↑
O8D Heat shock protein 60 P10809 61.346 5,7 15 81 ↑
O241B T cell receptor alpha chain AAK37512 13.640 7,88 40 66 ↑
N24B Interleukin-32 P24001 15.127 4,8 23 70 ↑
N97B
Chain A, Crystal Structure Of Human Enolase 1 (Alpha-enolase) P06733 47.481 7,01 18 69 ↑ N296 A Neuropolypeptide h3 (Phosphatidylethanolamine- binding protein 1) P30086 21.027 7,42 41 78 ↓ N35B TFEC protein
(Transcription factor EC) O14948 22.696 9,67 17 71 ↑
N139C Microfibrillar-associated
protein 3 (MFAP3) O75121 34.362 4,9 15 68 ↓
P46D LOC643854 protein AAI01323 61.880 5,45 9 74 ↑ P228A TPA protein Q6LBF5 13.392 7,85 24 72 ↓ P229A Unnamed protein product BAC04847 32.496 8,51 14 70 ↓ P10C Protein FAM180A Q6UWF9 19.834 8,59 16 68 ↓ P15C hCG1989686 EAX08132 11.676 9,55 32 68 ↓ P14A Uncharacterized protein
C12orf45 Q8N5I9 20.168 5,1 20 69 ↓ P48A COMM domain containing 3 Q5T8Z0 18.286 6,14 20 83 ↓
44
C55D GDDM protein Q86XP7 4.086 10,54 80 71 ↑ C151A Interphase cyctoplasmic
foci protein 45 variant G6DPS4 35.150 8,11 15 68 ↑ O218B IFT172 protein A5PKZ0 60.583 5,66 11 68 ↑ O243B KIAA1179 protein Q9UG01 142.340 5,51 9 67 ↑
N244
A hCG2041492 EAW97522 15.331 5,31 36 66 ↓
Ghi chú: ↑, protein biểu hiện tăng; ↓, protein biểu hiện giảm; -, protein không biểu
hiện ở mẫu bệnh; +, protein không biểu hiện ở mẫu mô bình thường.
Sử dụng kỹ thuật MALDI-TOF MS, chúng tôi đã nhận dạng được 39 spot protein, trong đó có 27 spot tương ứng với 25 protein đã được định danh và 12 protein giả thuyết.
Tóm lại, kết hợp kỹ thuật MALDI-TOF MS và tra cứu cơ ở dữ liệu, chúng tôi đã nhận dạng được 38 protein trên tổng số 52 spot protein biểu hiện khác biêt trên các bản gel mô gan của bệnh nhân HCC.