Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận dạng được 4 protein trong mô gan của bệnh nhân có phản ứng miễn dịch với kháng thể trong huyết tương của chính bệnh nhân đó là: protein ST7L biểu hiện tăng và protein MHC lớp I, HSP27, aldehyde dehydrogenase biểu hiện giảm ở mô gan ung thư so với mô gan bình thường. Các protein này được tiếp tục tìm hiểu sâu hơn về chức năng và mối liên hệ của chúng với tình trạng ung thư.
Protein đầu tiên là ST7L, đây là protein được mã hóa bởi gene ST7L, gene này tương đồng với gene ức chế khối u thuộc vùng 7q31 của nhiễm sắc thể. Gene này được sắp xếp trên cùng một nhiễm sắc thể với gene WNT2B, vùng gene này có thể bị mất hoặc có hiện tượng tái sắp xếp trong một số loại ung thư [48]. Protein ST7L được xác định là có vai trò ức chế sự phát triển của tế bào khối u. Quan trọng
57
hơn nữa, protein này có phản ứng miễn dịch với kháng thể trong huyết tương của bệnh nhân HCC khi thực hiện phản ứng Western blot và biểu hiện tăng ở mẫu mô gan ung thư so với mô bình thường. Chúng tôi đưa ra hai giả thuyết để lý giải hiện tương này là: do protein ST7L tăng nhưng bị biến đổi về cấu trúc nên không thực hiện được chức năng và bị cơ thể nhận là “lạ” và sinh đáp ứng miễn dịch, hoặc trong giai đoạn này, người bệnh ở giai đoạn phục hồi, nên cơ thể có phản ứng để kìm hãm sự phát triển của khối u. Đây là protein lần đầu tiên được phát hiện trong nghiên cứu của chúng tôi, hơn nữa, chưa có tài liệu nào về HCC đề cập tới protein này. Điều này giúp gợi mở hướng nghiên cứu mới để tìm hiểu về cơ chế hoạt động của ST7L trong ung thư nói chung và HCC nói riêng, đồng thời khẳng định tiềm năng trở thành chỉ thị để chẩn đoán HCC của protein này.
Trong quá trình miễn dịch chống ung thư, dường như vai trò của sự đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào thường chiếm ưu thế. Quá trình này có sự tham gia của phức hệ phù hợp tổ chức mô chủ yếu (MHC), ở người là HLA. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận dạng được protein MHC lớp I (MHC I) biểu hiện giảm ở mô gan ung thư so với mô gan bình thường. Protein MHC được tích lũy trong lưới nội chất và làm nhiệm vụ trung chuyển phân tử. Trong tế bào mang virus hay tế bào ung thư, các kháng nguyên nội sinh (kháng nguyên virus, kháng nguyên ung thư) nằm trong tế bào chất, sẽ được các vi thể proteasome chế biến thành các peptide kháng nguyên. Các peptide này được TAP vận chuyển vào khoang lưới nội chất để liên kết với rãnh của MHC I. Sau đó, phức hệ MHC I - peptide kháng nguyên được đóng gói bằng cách bọc màng và được vận chuyển lên bề mặt tế bào để trình diện cho tế bào TCD8+, kích thích tế bào T sản sinh ra Lymphokin để tiêu diệt tế bào mang kháng nguyên nội sinh (hình 15). Khi tế bào bị nhiễm virus nội sinh, lượng MHC I luôn được tổng hợp dư thừa, sẵn sàng làm nhiệm vụ trình diện kháng nguyên nội sinh [3, 7]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, protein MHC I biểu hiện giảm, điều này gợi ý rằng, quá trình tiến triển thành ung thư ở tế bào gan đã làm ảnh hưởng tới sự đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, tế bào ung thư không bị tiêu diệt do thiếu sự nhận diện kháng nguyên nội sinh. Hơn nữa, khi thực hiện phản ứng
58
Western blot hai chiều, tại vị trí spot MHC I có xảy ra phản ứng miễn dịch và phát quang, điều này có thể do kháng thể trong huyết tương đã nhận diện MHC I như là kháng nguyên ung thư gan.
Hình 15. Sơ đồ nhận diện kháng nguyên nhờ protein MHC lớp I [44]
Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy các protein sốc nhiệt: HSP27, HSP60 đều biểu hiện giảm ở mô gan ung thư so với mô gan bình thường. Protein HSP27 là phân tử đa chức năng, biểu hiện khác nhau trong các giai đoạn biệt hóa và sinh trưởng tế bào. HSP còn được gọi là các stress protein, là một nhóm các protein có mặt ở tất cả các tế bào sống, được đặt tên theo khối lượng phân tử của chúng. Chúng xuất hiện hiện khi một tế bào phải trải qua những dạng stress của môi trường như nóng, lạnh hay thiếu oxy. Ở điều kiện bình thường, các HSP27 cũng xuất hiện trong tế bào và hoạt động như các chaperone đảm bảo cho các protein của tế bào hoàn thiện về cấu trúc phù hợp với chức năng tại một vị trí vào một thời điểm thích hợp, đồng thời vận chuyển các protein già đến “thùng rác” trong tế bào, protein này còn liên kết với actin tránh phá hủy actin, giúp ổn định cấu trúc tế bào. Các protein này cũng có vai trò trong trình diện kháng nguyên giúp hệ miễn dịch nhận ra các tế bào bệnh thông qua việc kích thích vi thể proteasome chế biến kháng nguyên nội sinh. HSP27 còn kích thích sản sinh interleukin-1 giúp hoạt hóa đại thực bào và
59
kích hoạt phản ứng viêm [51]. HSP27 ức chế hoạt hóa caspase 9 gây ức chế quá trình apoptosis. HSP27 biểu hiện giảm có thể ảnh hưởng tới nhiều hoạt động chức năng của tế bào gan và giúp tế bào gan ung thư thoát khỏi apoptosis. Biểu hiện bất thường của HSP27 cũng được phát hiện ở ung thư ruột kết và ung thư tuyến tiền liệt. Kết quả này của chúng tôi tương đồng với kết quả nghiên cứu của Li và cs (2005), Wong và cs (2006), Yao và cs (2007) [21, 38, 39].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi còn nhận dạng được protein aldehyde dehydrogenase có biểu hiện giảm ở mô gan ung thư so với mô gan bình thường. Đây là protein thuộc họ enzym tham gia phản ứng oxy hóa khử, tham gia quá trình chuyển hóa ethanol trong gan và truyền điện tử [51]. Enzyme này giảm có thể là hệ quả của quá trình tiến triển thành ung thư gây suy giảm chức năng gan, hoặc thiếu hụt enzym này dẫn tới tình trạng gan nhiễm độc, từ đó bị biến đổi thành tế bào ung thư. Hơn nữa, protein này có phản ứng miễn dịch với huyết tương của bệnh nhân ung thư gan, đây có thể là một loại kháng nguyên liên quan đến ung thư gan. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Li và cs, nhóm nghiên cứu này cũng chú ý nghiên cứu tìm hiểu tiềm năng của aldehyde dehydrogenase trở thành chỉ thị phân tử phát hiện HCC [21].
Cùng với những biểu hiện khác biệt quan trọng ở trên, chúng tôi cũng nhận thấy sự biểu hiện đa dạng của những protein khác biệt không chỉ là đặc trưng của riêng một bệnh. Những chỉ thị riêng cho bệnh có thể được hình thành trong một chuỗi các tác động tổng hợp với các bệnh khác, điều này góp phần bổ sung cho ý kiến chỉ thị ung thư có thể không đặc hiệu với riêng một loại ung thư nào mà phản ánh mối liên quan chặt chẽ giữa sự tiến triển của bệnh ung thư với các quá trình viêm và bệnh lý khác trong cơ thể [12].
60
KẾT LUẬN
Bước đầu phân tích proteomics miễn dịch của bệnh nhân ung thư gan, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1. Bằng kỹ thuật điện di hai chiều đã phân tách được các protein trong mô gan ung thư và mô gan bình thường của 6 bệnh nhân ung thư gan thành các spot riêng rẽ trên các bản gel điện di.
2. Đã xác định được các spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư và mô gan bình thường của từng bệnh nhân ung thư gan. Trong đó có 52 spot khác biệt chung ở các bệnh nhân gồm: 23 spot biểu hiện tăng, 18 spot biểu hiện giảm, 6 spot chỉ xuất hiện ở bản gel mô ung thư, 5 spot không xuất hiện ở bản gel mô ung thư.
3. Đã nhận dạng được 52 spot tương ứng với 38 protein đã được định danh và 12 protein giả thuyết. Các protein được chia thành 5 nhóm chức năng, bao gồm: nhóm protein liên quan đến chu trình tế bào và apoptosis; protein liên quan đến quá trình miễn dịch và bảo vệ cơ thể; protein tham gia cấu trúc tế bào; protein tham gia các quá trình trao đổi chất và protein tham gia vào quá trình phiên mã, dịch mã và cải biến sau phiên mã, dịch mã. Trong đó, protein tham gia vào quá trình miễn dịch và bảo vệ cơ thể chiếm tỷ lệ cao nhất (~29%), thấp nhất là nhóm protein tham gia vào cấu trúc tế bào (~5%).
4. Sử dụng kit ECL Advance estern Blotting Detection, đã xác định được tỷ lệ pha loãng tối ưu kháng thể bậc một và thẩm tách miễn dịch thành công trên 4 cặp bản gel điện di 2 chiều của 4 bệnh nhân ung thư gan.
5. Bằng kỹ thuật thẩm tách miễn dịch Western blot hai chiều đã xác định được 4 protein có phản ứng miễn dịch là: protein ST7L biểu hiện tăng và protein MHC lớp I, HSP27, aldehyde dehydrogenase biểu hiện giảm ở mô gan ung thư so với mô gan bình thường.
61
KIẾN NGHỊ
Trải qua nghiên cứu thực tế, chúng tôi đưa ra một số kiến nghị sau:
1. Tiếp tục nhận dạng các spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô ung thư so với mô gan thường và kết hợp với kết quả phân tích thẩm tách miễn dịch Western blot hai chiều trên số lượng bệnh nhân lớn hơn nhằm tìm ra các protein có tính kháng nguyên đặc trưng cho ung thư gan.
2. Tiếp tục thu thập mẫu và phân tích proteomics miễn dịch mô gan của bệnh nhân ung thư gan ở các giai đoạn ung thư khác nhau nhằm phân tích sự biến đổi thành phần các protein liên quan đến bệnh.
3. Thu thập mẫu huyết tương của bệnh nhân viêm gan B và C đang tiến triển thành ung thư gan và bệnh nhân ung thư gan có tiền sử nhiễm HBV và HCV nhằm tìm hiểu mối liên hệ giữa viêm gan B, C và ung thư gan trên các đối tượng bệnh nhân ung thư gan ở Việt Nam.
62
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Phan Văn Chi (2006), PROTEOMICS Khoa học về hệ protein, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội.
2. Phan Văn Chi (2009), “Thực trạng nghiên cứu về Proteomics”, Hội thảo VNProteomics lần 1, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và công nghệ.
3. Đỗ Ngọc Liên (2004), Miễn dịch học cơ sở, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.
4. Hoàng Văn Sơn (2009), “Proteomics lâm sàng”, Hội thảo VNProteomics lần 1, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và công nghệ.
5. Hoàng Văn Sơn (2011), “Các chỉ tố ung thư gan”, Tạp chí y học Việt Nam, 348, 5-11.
6. Bùi Phương Thảo, Lê Lan Phương, Trịnh Hồng Thái (2011), “Phân tích các protein biểu hiện khác biệt của mô gan ở bệnh nhân ung thư gan”, Tạp chí y học Việt Nam, 348, 67-71.
7. Trường Đại học Y Hà Nội (2006), Miễn dịch học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
Tiếng Anh
8. American Cancer Society (2012), Cancer Facts & Figures, National Health Council.
9. Bradford M. M. (1976), “A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding”,
Analytical Biochemistry, 72, 248-254.
10. Chen Y. (2007), “Identification of tumor-associated antigens as markers for immunodiagnosis of human cancers”, ETD Collection for University of Texas, El Paso, Paper AAI3262904.
63
11. Chen Y., Zhou Y., Qiu S., Wang K., Liu S., Peng X.X., Li J., Tan E.M., Zhang J.Y. (2010), “Autoantibodies to tumor-associated antigens combined with abnormal alpha-fetoprotein enhance immunodiagnosis of hepatocellular carcinoma”, Cancer Letters, 289(1), 32-39.
12. Diamandis E.P. (2004), “Identification of serum amyloid A protein as a potentially useful biomarker for nasopharyngeal carcinoma”, Clinical Cancer Research, 10, 5293-5294.
13. Farazi P.A., Depinho R.A. (2006), “Hepatocellular carcinoma pathogenses: from genes to evironment”, Nature Reviews Cancer, 6, 674-687.
14. Farombi E.O. (2006), “Aflatoxin contamination of foods in developing countries: Implications for hepatocellular carcinoma and chemopreventive strategies”, African Journal of Biotechnology, 5(1), 001-014.
15. Govekar R. and Zingde S.M. (2007), “Cancer Proteomics: How far are we from the Clinics? ”, International Journal of Human Genetics, 7(1), 91-97. 16. He Q.Y., Lau G.K.K., Zhou Y., Yuen S.T., Lin M.C., Kung H.F. and Chiu J.F.
(2003), “Serum biomarkers of hepatitis B virus infected liver inflammation: A proteomic study”, Proteomics, 3(5), 666-674.
17. Jain K.K. (2002), “Role of proteomics in diagnosis of cancer”,
Technology in Cancer Research and Treatment, 1(4), 281-286.
18. Jemal A., Bray F., Center M. M., Ferlay J., Ward E., Forman D., (2011), “Global Cancer Statistics, CA Cancer J Clin, 61, 69-90.
19. Kim W., Lim S.O., Kim J.S., Ryu Y.H., Byeon J.Y., Kim H.J., Kim Y.L., Heo J.S., Park Y.M., and Jung G. (2003), “Comparison of Proteome between Hepatitis B virus-and Hepatitis C virus-Associated Hepatocellular Carcinoma”, Clinical Cancer Research, 9, 5493-5500.
64
20. Le L.P., Pham A.T., Trinh H.T. (2010), “Proteomics analysis of human hepatocellular carcinoma”, Vietnam National University Journal of Science, Natural Science and Technology, 26(1), 85-90.
21. Li C., Tan Y.X., Zhou H., Ding S.J., Li S.J., Ma D.J., Man X.B., Hong Y., Zhang L., Li L., Xia Q.C., Wu J.R., Wang H.Y., Zeng R. (2005), “Proteomic analysis of hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma: Identification of potential tumor markers”, Proteomics, 5(4), 1125-1139.
22. Li L., Chen S.H., Yu C.H., Li Y.M. and Wang S.Q. (2008), “Identification of Hepatocellular-Carcinoma-Associated Antigens and Autoantibodies by Serological Proteome Analysis Combined with Protein Microarray”, Journal of Proteome Research, 7(2), 611-620.
23. Liebler D.C. (2002), Introduction to proteomics, Human Press, Totowa, New Jersey.
24. Liu W., Peng B., Lu Y., Xu W., Qian W., Zhang J.Y. (2011), “Autoantibodies to tumor-associated antigens as biomarkers in cancer immunodiagnosis”,
Autoimmunity Reviews, 10(6), 331-335.
25. Long J., Lang Z.W., Wang H.G., Wang T.L., Wang B.E. (2010), “Glutamine synthetase as an early marker for hepatocellular carcinoma based on proteomic analysis of resected small hepatocellular carcinomas”, Hepatobiliary Pacreat Diseases International, 9(3), 296-305.
26. Looi K.S., Nakayasu E.S., Diaz R.A., Tan E.M., Almeida I.C., Zhang J.Y. (2008), “Using Proteomic Approach to Identify Tumor-Associated Antigens as Markers in Hepatocellular Carcinoma”, Journal of Proteome Research, 7(9), 4004-4012.
27. Lu H., Goodell V., Disis M.L. (2008), “Humoral immunity directed against tumor-associated antigens as potential biomarkers for the early diagnosis of cancer”, Journal of Proteome Research, 7(4), 1388-1394.
65
28. Martin K., Ricciardelli C., Hoffmann P., K.Oehker M., (2011), “Exploring the Immunoproteome for Ovarian Cancer Biomarker Discovery”, International Journal of Molecular Sciences, 12, 410-28.
29. Mendy M., alton R. (2009), “Molecular pathogenesis and early detection of Hepatocellular perspectives from est Africa”, Cancer Letters; 286(1), 44-51.
30. Polanski M., Anderson N.L. (2006), “A list of candidate cancer biomarkers for targeted proteomics”, Biomark Insights, 1, 1-48.
31. Qin L.X., Tang Z.Y. (2002), “The prognostic molecular markers in hepatocellular carcinoma”, World Journal of Gastroenterology, 8(3), 385-392.
32. Rubin P., Hansen J.T. (2008), TNM Staging Atlas, Lippincott Williams & Wilkins, a Wolters Kluwer Business, Bogota, Colombia.
33. Takashima M., Kuramitsu Y., Yokoyama Y., Iizuka N., Harada T., Fujimoto M., Sakaida I., Okita K., Oka M., (2006), “Proteomic analysis of autonantibides in patients with hepatocellular carcinoma”, Proteomics, 6(13), 3894-3900.
34. Tan H., Low J., Lim S.G., Chung M.C. (2009), “Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection”, FEBS journal, 276(23), 6880-6904.
35. Tjalsma H., Schaeps R.M., Swinkels D.W. (2008), “Immunoproteomics: From biomarker discovery to diagnostic applications”, Proteomics Clinical Appllications, 2(2), 167-180.
36. Tran T.T., Le L.P, Trinh H.T (2011), “Analysis of differentially expressed proteins of plasma in hepatocellular carcinoma”, Vietnam National University Journal of Science, Natural Science and Technology, 27(2), 279-284.
37. Westermeier R., Naven T. (2002), Proteomics in Practice, Wiley-VCH Verlag-GmbH, Freiburg.
66
38. ong C.H., Chan S.K.P., Chan H.L.Y., Tsui S.K. . (2006), “The Molecular Diagnosis of Hepatitis B Virus-Associated Hepatocellular Carcinoma”,
Clinical Laboratory Sciences, 43(1), 69-101.
39. Yao D.F., Dong Z.Z., Yao M. (2007), “Specific molecular markers in hepatocellular carcinoma”, Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 6(3), 241-247.
40. Zhang J.Y., Megliorino R., Peng X.X., Tan E.M., Chen Y., Chan E.K. (2007), “Antibody detection using tumor-associated antigen mini-array in immunodiagnosing human hepatocellular carcinoma”, Journal of Hepatology, 46(1), 107-114.
Công cụ World Wide Web
41. http://benhvienk.com/index.php/vi/pcut/tin-tuc-phong-chong-ung-thu/677- dau-hieu-cua-benh-ung-thu-gan (5/6/2012) 42. http://cancerhelp.cancerresearchuk.org/type/liver-cancer/about/types-of- primary-liver-cancer (14/02/2012) 43. http://expasy.org/swiss-2dpage/viewer (5/6/2012) 44. http://igrid-ext.cryst.bbk.ac.uk/WWW/PhD_thesis.htm (10/06/2012) 45. http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/adult-primary-