Điện di hai chiều gồm: điện di phân vùng đẳng điện (IEF) để phân tách protein theo điểm đẳng điện và điện di SDS-PAGE để phân tách protein theo khối lượng và hình dạng phân tử. Quá trình này bắt đầu bằng việc làm trương thanh strip có gradient pH cố định (IPG strip) bằng đệm trương gel có chứa protein, sau 2 giờ, protein sẽ thấm hết vào thanh strip. Lượng protein tối đa mà sợi gel IPG strip dài 7cm và 17cm có thể thấm tương ứng là 100µg và 400µg.
Điện di đẳng điện được thực hiện trên hệ thống Protean IEF cell (Biorad, Mỹ) hoặc Ettan IPGphor3 (GE - Healthcare, Mỹ) để tập trung các phân tử protein vào vị trí tương ứng với pI của phân tử đó trên thanh IPG strip. Quá trình chạy điện di đẳng điện diễn ra theo 5 buớc được trình bày ở bảng 4.
Kết thúc điện di đẳng điện, các thanh IPG strip được ngâm trong đệm cân bằng I (Tris HCl 50mM pH 8,8; urea 6M, glycerol 30%, SDS 2%, DTT 0,1%) ở nhiệt độ phòng và đệm cân bằng II (Tris HCl 50mM pH 8,8; urea 6M, glycerol 30%, SDS 2%, IAA 0,25%), thực hiện trong bóng tối ở nhiệt độ phòng. Mỗi bước cân bằng được thực hiện 3 lần, mỗi lần 10 phút.
28
Điện di chiều hai được tiến hành trên gel polyacrylamide 10% có SDS (SDS- PAGE) để tiếp tục phân tách protein theo khối lượng phân tử.
Bảng 4. Các bước chạy điện di đẳng điện trên thanh strip dài 7cm và 17cm
Hiệu điện thế (V) Thời gian (t) V.t (V - giờ) Chế độ tăng V
7cm 17cm 7cm 17cm 7cm 17cm
Bước 1 50 12 giờ 0 Trương gel
Bước 2 125 2 giờ ... ... Tuyến tính
Bước 3 250 15 phút ... ... Nhanh
Bước 4 4.000 10.000 1 giờ 2 giờ ... ... Chậm
Bước 5 4.000 10.000 ... ... 10.000 40.000 Nhanh
Tổng ~ 18 giờ ~ 20 giờ ~ 14.000 ~ 60.000
Trong nghiên cứu này, mỗi cặp mẫu bệnh và đối chứng của từng bệnh nhân được tiến hành điện di hai chiều thành hai cặp bản gel. Sau khi kết thúc điện di hai chiều, một cặp bản gel được cố định protein bằng dung dịch chứa axit phosphoric 1,3%, methanol 20% trong một giờ, sau đó, nhuộm qua đêm bằng Coomassie G250 theo phương pháp nhuộm Colloidal Coomassie Brilliant Blue của Neuhoff (1988). Phương pháp nhuộm này đạt độ nhạy cao, có thể hiện lên các spot chỉ chứa 30ng protein [37]. Hình ảnh các protein trên bản gel này được chụp lại, lưu giữ, phân tích đánh giá mức độ biểu hiện và so sánh với cơ sở dữ liệu sẵn có hoặc cắt, thủy phân spot protein để phân tích khối phổ. Cặp bản gel còn lại sẽ được dùng để điện chuyển sang màng PVDF để thực hiện phản ứng miễn dịch Western Blot.