Phần mềm chuyên dụng Phoretix cho phép so sánh sự biểu hiện của các protein thuộc mô gan ung thư so với mô gan bình thường thông qua sự biểu hiện của các spot trên các bản gel 2-DE. Phần mềm giúp xác định các spot tương ứng trên các bản gel, đưa ra giá trị cường độ khối trung bình của các spot. Ngoài ra, phần mềm còn đưa ra hình ảnh ba chiều (3-D) của các spot, trong đó, độ lớn của spot được thể hiện bằng bề rộng của đáy spot trên hình 3-D, độ đậm của spot được thể hiện bằng chiều cao của spot tính từ đáy lên đỉnh và độ sắc nét của spot nhuộm màu coomasie được thể hiện bằng độ nhọn của spot ấy trên hình ảnh 3-D (hình 7). Đây là cơ sở để so sánh mức độ biểu hiện của từng spot trên bản gel.
Căn cứ vào các thông số thu được khi phân tích hình ảnh bản gel 2-DE, chúng tôi có thể chỉ ra các spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô ung thư (+); các spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt trên bản gel mô bình thường (-); các spot biểu hiện tăng (↑) và các spot biểu hiện giảm (↓) ở bản gel mô ung thư so với bản gel mô bình thường (hình 8).
37
Hình 7. Hình ảnh 3-D của spot trên bản gel điện di hai chiều
A - Mô gan bình thường B - Mô gan ung thư
Hình 8. Minh họa các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô ung thư so với bản gel mô bình thường
Khi phân tích độc lập từng cặp bản gel, chúng tôi đã xác định được các spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư so với mô gan bình thường trên từng cặp bản gel 2-DE phân tách protein trong khoảng pH 3 - 10, dài 17cm (bảng 6) và phân tách protein trong khoảng pH 4 - 7, dài 7cm (bảng 7). Các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel 2-DE mẫu protein mô gan ung thư so với mô gan bình thường được minh họa ở hình 9.
38
- ô gan bình thường B - ô gan ung thư
Ghi chú: A1, B1 - Bản gel 2-DE dài 17cm, pH 3 - 10 A2, B2 - Bản gel 2-DE dài 7cm, pH 4 - 7
Hình 9. Các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel 2-DE mẫu mô gan ung thư so với mô gan bình thường của bệnh nhân HCC mã 8935
A1 B
1
39
Bảng 6. Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư so với mô gan bình thường của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 17cm, pH 3 - 10
8261 8460 8935 8977 9242 10480 ↑ 31 16 51 23 21 39 ↓ 19 33 20 22 27 21 - 7 11 2 4 1 4 + 2 4 7 3 2 5 Tổng 59 64 80 52 51 69
Bảng 7. Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư so với mô gan bình thường của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 7cm, pH 4 - 7
8460 8935 8977 9242 10480 ↑ 6 17 18 11 16 ↓ 9 3 10 5 8 - 5 1 1 2 1 + 1 2 3 2 2 Tổng 21 23 32 20 27
Ghi chú: Spot protein biểu hiện tăng (↑); spot protein biểu hiện giảm (↓) ở bản gel mẫu
ung thư so với bản gel mô bình thường; spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mẫu ung thư (+); xuất hiện mờ nhạt hoặc không thấy trên bản gel mẫu mô ung thư (-).
Thống kê các spot protein biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô gan ung thư so với bản gel mô gan bình thường của cả 6 bệnh nhân HCC, chúng tôi nhận thấy có 52 spot khác biệt rõ ràng, xuất hiện trên các bản gel mô gan ung thư so với mô gan bình thường, bao gồm:
- 6 spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô ung thư - 5 spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô đối chứng - 23 spot biểu hiện tăng ở bản gel mô ung thư
40
Khi so sánh hình ảnh các bản gel điện di thu được trong nghiên cứu này với hình ảnh bản gel mô gan người trong cơ sở dữ liệu SWISS-2D-PAGE [43], chúng tôi nhận dạng được 13 protein tương ứng với 13 spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô gan ung thư so với bản gel mô gan bình thường (bảng 8).
Bảng 8. Danh sách các protein biểu hiện khác biệt trên bản gel của mô gan ung thư so với mô gan bình thường được xác định dựa trên cơ sở dữ liệu EMBL
STT Protein Yếu tố nhận dạng protein Cường độ khối trung bình Biểu hiện ĐC HCC 1 Alpha-1-antitrypsin (Alpha-1-protease inhibitor) (A1AT) P01009 0,0015 0,608 +
2 Protein disulfide-isomerase (PDIA1) P07237 0,738 0,078 ↓
3 Cellular tumor antigen p53 (p53) P04637 0,114 − −
4 Beta-actin, cytoplasmic 1 (ACTB) P60709 0,003 4,599 +
5 Haptoglobin (HPT) P00738 0,002 0,839 +
6 Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) P12004 0,0008 0,265 +
7 Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase (GAPDH/G3P) P04406 0,248 − −
8 Cathepsin D (CATD) P07339 0,0007 0,124 +
9 Enoyl-CoA hydratase, mitochondrial
(ECHM) P30084 0,0005 0,129 +
10 Superoxide dismutase [Mn],
mitochondrial (SODM) P04179 2,730 0,315 ↓
11 UMP-CMP kinase (KYC) P30085 0,306 0,014 ↓
12 Superoxide dismutase [Cu-Zn] (SODC) P00441 4,524 1,467 ↓
13 Glutamate dehydrogenase 1,
mitochondrial (GDH/ DHE3) P00367 0,686 − −
Ghi chú: ↑, protein biểu hiện tăng; ↓, protein biểu hiện giảm; -, protein không biểu
hiện ở mẫu bệnh; +, protein không biểu hiện ở mẫu mô bình thường; ĐC, bản gel mô gan bình thường; HCC, bản gel mô gan ung thư.
41