Sau khi xác định được tỷ lệ pha loãng kháng thể bậc một thích hợp, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng Western blot hai chiều. Các phân tử protein sau khi được phân tách trên bản gel điện di hai chiều 7cm trong khoảng pH 4 - 7 được điện chuyển lên màng. Khi ủ màng với huyết tương của bệnh nhân HCC đã pha loãng 800 lần, các kháng thể trong huyết tương gắn với protein đặc hiệu trên màng, sau đó, tiếp tục ủ màng với kháng thê bậc 2 gắn enzyme xúc tác cho phản ứng hiện màu để phát hiện các spot protein có phản ứng miễn dịch.
Chúng tôi đã thực hiện thành công phản ứng Western blot hai chiều trên bản gel 2-DE mẫu mô gan của 4 bệnh nhân HCC. Kết quả cho thấy trên màng đã xuất hiện các điểm sáng sắc nét (hình 13 và phụ lục 4), đây chính là vị trí của các spot protein có tính kháng nguyên. Cường độ sáng của từng điểm là tiêu chí đánh giá mức độ biểu hiện và đáp ứng miễn dịch của protein trên màng. Hình ảnh Western blot
47
được so sánh với bản gel 2-DE 7cm được nhuộm Coomassie G250 nhằm xác định các protein có tính kháng nguyên.
A - Mô gan bình thường B - Mô gan ung thư
Hình 13. Kết quả phản ứng Western Blot mẫu mô gan của bệnh nhân 8977
Dựa vào vị trí tương ứng của các spot phát sáng trên màng PVDF với các spot trên bản gel 2-DE dài 7cm và kết quả định danh protein, chúng tôi đã xác định được 4 protein trong mô gan của bệnh nhân có phản ứng miễn dịch với kháng thể trong huyết tương của chính bệnh nhân đó là: protein ST7L biểu hiện tăng và protein MHC lớp I, HSP27, aldehyde dehydrogenase biểu hiện giảm ở mô gan ung thư so với mô gan bình thường.