Nghiên cứu proteomics miễn dịch ung thư gan

Ung thư có thể coi là bệnh về hệ protein, bởi chính những đột biến di truyền làm sai lệch quá trình truyền tín hiệu, làm tế bào sai hỏng không bị loại bỏ, đồng thời khiến tế bào tăng sinh không kiểm soát được. Hiện nay, đa số các chỉ thị ung thư đang được sử dụng là kết quả nghiên cứu về protein, vì protein là sản phẩm cuối cùng của gene và tác động trực tiếp đến các quá trình sinh học. Hơn nữa, protein là

18

thành phần phong phú nhất của tế bào. Do đó, các nhà khoa học đang tập trung ứng dụng kỹ thuật proteomics trong nghiên cứu tìm kiếm các chỉ thị ung thư là các protein nhằm chẩn đoán sớm ung thư.

Proteomics ung thư là ứng dụng kỹ thuật proteomics để xác định sự thay đổi định tính và định lượng của protein được tìm thấy trong mô hoặc các dịch cơ thể của người bị ung thư, so sánh với người bình thường khỏe mạnh nhằm giúp cho việc chẩn đoán ung thư, tiên lượng và điều trị có hiệu quả hơn [15].

Proteomics miễn dịch là một khái niệm tương đối mới trong lĩnh vực nghiên cứu proteomics. Proteomics miễn dịch nghiên cứu về tập hợp các protein tham gia đáp ứng miễn dịch [35]. Trong quá trình đáp ứng miễn dịch chống ung thư, trong huyết thanh của bệnh nhân ung thư có xuất hiện các tự kháng thể đặc hiệu chống lại các kháng nguyên ung thư của chính cơ thể. Đây chính là đối tượng nghiên cứu của proteomics miễn dịch ung thư.

Hiện nay, nhiều nghiên cứu proteomics miễn dịch trên dòng tế bào ung thư, mô hình động vật, phân tích trực tiếp trên huyết tương và mô gan của bệnh nhân ung thư gan đã và đang được tiến hành rộng khắp trên toàn thế giới và đã thu được nhiều kết quả khả quan [15].

Để xác định các tự kháng thể có tiềm năng làm chỉ thị phân tử trong chẩn đoán HCC, năm 2006, Takashima và cs đã tiến hành phân tích các tự kháng thể trong huyết thanh cho thấy có phản ứng miễn dịch với các protein trong mô ung thư lấy từ bệnh nhân HCC. Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã tiến hành phân tách protein của 15 cặp mẫu mô ung thư và mô thường bằng kỹ thuật điện di hai chiều, sau đó chuyển lên màng và thực hiện phản ứng miễn dịch với huyết thanh của chính bệnh nhân đó. Bằng cách so sánh từng phần, họ đã xác định được 4 spot có phản ứng miễn dịch có độ nhạy với thuốc nhuộm ở mô ung thư mạnh hơn so với mô bình thường. Những protein này được nhận dạng bằng sắc ký lỏng kết nối với khối phổ (LC-MS/MS), đó là protein sốc nhiệt 70kDa (HSP70), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, peroxiredoxin và manganese superoxide dismutase (Mn-SOD).

19

Trong huyết thanh bệnh nhân HCC, tần suất của các tự kháng thể kháng lại các protein lần lượt là 7/15 (46,7%); 5/15 (33,3%); 5/15 (33,3%) và 6/15 (40%), trong khi đó, ở mô đối chứng là 2/20 (10%); 7/20 (35%); 0/20 (0%) và 2/20 (10%). Tiếp tục phân tích miễn dịch sử dụng các protein thương mại đã tinh sạch được tiến hành để khẳng định tính đặc hiệu của các tự kháng thể. Phân tích thống kê các tự kháng thể kháng lại các protein HSP70, peroxiredoxin và Mn-SOD cho thấy những phản ứng miễn dịch có độ đặc hiệu cao trong huyết thanh HCC. Ba kháng thể được cho là đặc hiệu đối với bệnh HCC và có thể là các chỉ thị sinh học chẩn đoán bệnh [33].

Trước đây, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng trong quá trình chuyển dạng từ xơ gan, viêm gan thành ung thư gan, trong cơ thể xuất hiện các TAA kích thích sinh ra tự kháng thể. Các tự kháng thể này có thể xuất hiện trong huyết thanh trước khi phát hiện biểu hiện chuyển dạng ác tính. Để đánh giá sự biểu hiện của các tự kháng thể trong các trạng thái bệnh lý về gan, năm 2007, Zhang và cs đã tiến hành sàng lọc huyết thanh của 30 bệnh nhân xơ gan, 30 bệnh nhân viêm gan và 142 bệnh nhân HCC bằng việc sử dụng 8 TAA chọn trước là các protein có liên quan đến điều hòa chu trình tế bào, yếu tố phiên mã đang được nghiên cứu rộng rãi, gồm: protein Imp1, p62, Koc, p53, c-myc, cyclin B1, survivin và p16. Sử dụng kỹ thuật hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) để phát hiện các kháng thể kháng 8 TAA trong huyết thanh của các đối tượng được nghiên cứu, kết quả dương tính được kiểm tra lại bằng Western blot và xét nghiệm kết tủa miễn dịch. Kết quả cho thấy tỷ lệ xuất hiện phản ứng dương tính của tự kháng thể trong huyết thanh với từng TAA biến đổi trong khoảng từ 9,9 - 21,8%, nhưng khi kết hợp thêm lần lượt từng TAA cho tới khi đủ 8 TAA thì thấy tỷ lệ phản ứng dương tính với kháng thể tăng lên đến 59,8% ở bệnh nhân HCC. Tỷ lệ này cao hơn hẳn so với tỷ lệ phản ứng dương tính với 8 TAA ở bệnh nhân viêm gan, xơ gan và người bình thường lần lượt là: 20%, 30% và 12,2%. Nghiên cứu này đã chứng minh rằng quá trình chuyển dạng ác tính thành ung thư có liên quan đến việc tăng phản ứng của tự kháng thể với một số protein nhất định của tế bào, việc sử dụng mini-array gồm 8 TAA tăng cường phát hiện tự kháng thể có thể dùng để chẩn đoán HCC [40].

20

Khi nghiên cứu về quá trình chuyển dạng ác tính của tế bào gan, các nhà khoa học đã sử dụng tự kháng thể trong huyết thanh trong sàng lọc miễn dịch thư viện biểu hiện cDNA của tế bào ung thư gan HepG2 để xác định kháng nguyên liên quan đến quá trình này. Năm 2007, nhóm nghiên cứu của Chen tại đại học Texas đã tiến hành nghiên cứu xác định các kháng nguyên liên quan đến khối u như những chỉ thị cho chẩn đoán miễn dịch ung thư gan. Trong nghiên cứu này, huyết thanh của bệnh nhân HCC được sử dụng để sàng lọc miễn dịch từ thư viện biểu hiện cDNA của tế bào HepG2. Kết quả sàng lọc thư viện biểu hiện cDNA HepG2 đã chỉ ra 27 gene bao gồm 21 gene đã biết và 6 gene chưa biết. Trong 21 gene đã biết thì 11 gene liên quan đến quá trình chết theo chương trình, biệt hóa và tăng sinh của tế bào cũng như chế biến kháng nguyên, 10 gene là liên quan đến các ung thư khác và 3 gene liên quan đến HCC. Dựa vào ý nghĩa chức năng và mối liên hệ với ung thư gan, HCC-1 (Suil) và HCC-13 (RalA) được xác định có thể liên quan đến di truyền ung thư HCC và được lựa chọn cho những nghiến cứu tiếp theo: phân tích huyết thanh bằng ELISA và Western blot ở các điều kiện khác nhau. Việc xác định biểu hiện protein của cả hai kháng nguyên được đánh giá bằng hóa mô miễn dịch. Kết quả nghiên cứu này đã chứng minh rằng hai TAA được xác định là Suil và RalA từ thư viện biểu hiện cDNA HepG2 có phản ứng miễn dịch ở HCC cao hơn đáng kể so với viêm gan mạn tính, xơ gan cũng như ở người bình thường. Điều đó khẳng định rằng hai kháng nguyên này có thể là những chỉ thị ung thư trong chẩn đoán HCC [10].

Năm 2008, Li và cs đã tiến hành xác định các kháng nguyên khối u và tự kháng thể của bệnh nhân HCC sử dụng phương pháp phân tích proteome huyết tương kết hợp với protein microarray. Họ tiến hành phân tách protein tổng số từ hai dòng tế bào ung thư thực nghiệm HepG2 và HepG2.2.15 bằng điện di hai chiều. Sau đó, chuyển các protein đã được phân tách lên màng Polyvinylidene Fluoride (PVDF). Đầu tiên, protein từ dòng tế bào HepG2 được ủ với mẫu huyết thanh thu được từ 8 bệnh nhân HCC liên quan đến HBV. Huyết thanh bình thường được sử dụng làm đối chứng. Protein của dòng tế bào HepG2.2.15 được ủ với mẫu trộn từ mẫu huyết thanh của 10 bệnh nhân HCC liên quan đến HBV và 10 bệnh nhân HCC âm tính với HBV. Các nhà nghiên cứu

21

đã phát hiện 6 spot protein kháng nguyên của dòng tế bào HepG2 có phản ứng với huyết thanh của bệnh nhân HCC mà không phản ứng với huyết thanh của người bình thường. Trong trường hợp HepG2.2.15, họ cũng đã phát hiện được 10 spot protein kháng nguyên có phản ứng với huyết thanh người bệnh mà không phản ứng với huyết thanh của người bình thường. Kết quả trên đã phản ánh sự khác nhau giữa các tự kháng thể của bệnh nhân HCC liên quan đến HBV và bệnh nhân HCC không liên quan đến HBV. Các protein trên được nhận dạng bằng phương pháp phân tích khối phổ MALDI- TOF và phần mềm Mascot. Nhóm nghiên cứu đã xác định được 13 kháng nguyên liên quan đến HCC. Tính kháng nguyên của các protein này được khẳng định thêm bằng cách sử dụng kỹ thuật Western blotting và phân tích protein microarray. Kết quả chỉ ra rằng, tần suất của các phản ứng dương tính với DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp), yếu tố kéo dài dịch mã 2 (eEF2), yếu tố cảm ứng apoptosis, heterogeneous nuclear A2 (hnRNP A2), protein liên kết với prostatic (PBP), triosephosphate isomerase (TIM) ở mẫu ung thư cao hơn đáng kể so với bình thường và viêm gan mạn tính. Phản ứng dương tính với DEAD, eEF2, AIF và PBP là thường xuyên xảy ra ở HCC hơn bất kỳ bệnh ung thư khác. Độ nhạy của tất cả kháng nguyên HCC từ 50% đến 85%. Vì vậy, các nhà nghiên cứu kết luận rằng việc phát hiện các tự kháng thể kháng lại các kháng nguyên trên có thể có giá trị trong việc chẩn đoán sớm ung thư gan [22].

Năm 2008, Looi và cs đã dùng phương pháp proteomics để xác định các TAA liên quan đến HCC. Nghiên cứu được tiến hành trên mẫu huyết thanh của 20 bệnh nhân HCC, 30 bệnh nhân viêm gan mạn tính, 30 bệnh nhân xơ gan và huyết thanh của 10 người bình thường khỏe mạnh và dòng tế bào ung thư gan HepG2. Trong số 34 spot protein có phản ứng miễn dịch được cắt ra khỏi bản gel điện di hai chiều, thủy phân protein bằng trypsin và phân tích LC-MS/MS, các tác giả đã nhận dạng được 28 protein. 17/28 protein không chỉ phản ứng với kháng thể trong huyết thanh của bệnh nhân HCC mà còn phản ứng với kháng thể trong huyết tương của bệnh nhân tiền ung thư. 11/28 protein chỉ phản ứng với kháng thể trong huyết tương của bệnh nhân HCC, nhóm protein này có tiềm năng lớn để trở thành chỉ thị sinh học của ung thư gan. Ngoài ra, để tìm hiểu mối liên quan của các protein đã nhận

22

dạng với ung thư, tác giả đã tìm kiếm trên Pubmed về cơ sở dữ liệu protein. Theo kết quả tra cứu, 18/28 protein đã được báo cáo có liên quan đến ung thư: 3 protein liên quan ung thư vú; 4 protein liên quan HCC (GRP78, HSP70, serotransferrin, Mn-SOD); 11 protein còn lại liên quan đến các loại ung thư khác [26].

Gần đây, việc nhận dạng và mô tả đặc điểm của các TAA và dùng làm “TAA mini-array” để chẩn đoán miễn dịch ung thư là một hướng tiếp cận để phát hiện ung thư đang được quan tâm. Theo hướng nghiên cứu này, năm 2010, Zhang và cs đã tiến hành nghiên cứu “Sàng lọc miễn dịch ung thư tế bào biểu mô gan thông qua tự kháng thể và kháng nguyên liên quan đến khối u kết hợp với biểu hiện tăng bất thường của AFP”. Nhóm tác giả đã dùng các tự kháng thể trong huyết thanh của một bệnh nhân HCC làm mẫu dò để sàng lọc miễn dịch xác định các TAA có liên quan đến quá trình chuyển dạng ác tính của tế bào gan trong thư viện biểu hiện cDNA của dòng tế bào ung thư thực nghiệm HepG2. Theo cách này đã xác định được 2 gene là SUI1 và RA1A. Protein tái tổ hợp của 2 gene này là Sui1 và Ra1A được biểu hiện, tinh sạch và dùng làm kháng nguyên trong xét nghiệm miễn dịch để xác định sự có mặt của tự kháng thể trong huyết thanh của 77 bệnh nhân HCC, 30 bệnh nhân viêm gan mạn tính, 30 bệnh nhân xơ gan và 82 người bình thường. Tỷ lệ xuất hiện kháng thể kháng Sui1 và Ra1A trong huyết thanh bệnh nhân HCC lần lượt là 11,7% (9/77) và 19,5% (15/77), tỷ lệ này cao hơn đáng kể so với tỷ lệ xuất hiện kháng thể kháng lại 2 protein này trong huyết thanh của bệnh nhân xơ gan (3,3% và 3,3%) và không xuất hiện kháng thể kháng 2 protein này ở huyết tương bệnh nhân viêm gan và người bình thường. Khi bổ sung 2 protein này vào mini-array gồm 8 TAA (Imp1, p62, Koc, p53, c-myc, cyclin B1, survivin và p16 [40]) đã được nghiên cứu trước đó thì thấy tỷ lệ xuất hiện tự kháng thể kháng 10 TAA đạt tới 66,2%. Ngoài ra, khi kết hợp sử dụng 10 TAA trên để chẩn đoán ở những người có AFP biểu hiện bất thường độ nhạy tăng từ 66,2% lên 88,7% [11].

Hiện nay, nhiều nghiên cứu về proteomics miễn dịch ung thư đã xác định được các kháng nguyên liên quan đến khối u. Khi một TAA được xác định, các nhà nghiên cứu sẽ dùng nhiều phương pháp khác nhau để mô tả một cách toàn diện về

23

TAA, mối liên hệ của TAA với quá trình chuyển dạng tế bào ác tính và xác nhận tương tác của TAA với kháng thể kháng TAA nhằm đánh giá tiềm năng trở thành chỉ thị để chẩn đoán miễn dịch ung thư. Theo hướng này, năm 2011, Liu và cs đã tập trung nghiên cứu về hai TAA mới được tìm ra là p62 và p90 để tìm hiểu vai trò của chúng trong chẩn đoán miễn dịch [24].

Tại Việt Nam, những nghiên cứu proteomics mới chỉ được bắt đầu triển khai tại các Phòng thí nghiệm Trọng điểm (PTNTĐ) về công nghệ Gene và Protein được thiết lập trong giai đoạn 2001 - 2005 [2]. Ở nước ta đã có một số nghiên cứu về ung thư gan sử dụng kỹ thuật proteomics, tuy nhiên, các nghiên cứu mới chỉ bước đầu phân tích hệ protein mô gan của bệnh nhân ung thư, so sánh với mô gan của người bình thường nhằm tìm ra các protein biểu hiện khác biệt trên hai loại mô này. Năm 2010, nhóm nghiên của chúng tôi thuộc Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc PTNTĐ Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tiến hành nghiên cứu phân tích proteomics mô gan bệnh nhân ung thư gan nguyên phát đã xác định được 44 spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan bệnh nhân ung thư so với mô gan người bình thường, nhận dạng được 37/44 spot protein tương ứng với 28 protein đã được định danh và 8 protein giả thuyết. Trong đó, một số protein biểu hiện khác biệt đặc trưng giữa mô ung thư so với mô thường như: Annexin V, PCNA (biểu hiện tăng ở mô ung thư), p53, SODC (biểu hiện giảm ở mô ung thư) có tiềm năng trở thành chỉ thị của ung thư tế bào gan [20]. Năm 2011, chúng tôi đã tiến hành phân tích các protein biểu hiện khác biệt của mô gan ung thư và mô gan lành trên cùng lá gan của bệnh nhân ung thư gan [6], đồng thời cũng tiến hành phân tích biểu hiện khác biệt của protein huyết tương của bệnh nhân ung thư gan sử dụng kỹ thuật điện di hai chiều [36]. Tiếp tục thực hiện hướng nghiên cứu proteomics ung thư gan tại Việt Nam, trong đề tài này, chúng tôi đã kết hợp phân tích proteomics mô gan của bệnh nhân ung thư gan và thực hiện phản ứng miễn dịch Western blot hai chiều nhằm tìm ra các protein có biểu hiện khác biệt, đặc biệt là các protein kháng nguyên phản ứng miễn dịch với kháng thể trong huyết tương của bệnh nhân ung thư gan, đây là các protein có tiềm năng trở thành chỉ thị sinh học giúp chẩn đoán sớm ung thư gan.

24

Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP