Hình ảnh các bản gel điện di hai chiều và hình ảnh phát quang trên màng PVDF sau khi thực hiện phản ứng kháng nguyên - kháng thể được số hóa bằng cách quét vào máy tính có phần mềm chuyên dụng Phoretix (Shimazdu, Nhật Bản) để phân tích hình ảnh. Trước tiên, phần mềm sẽ xác định tất cả các spot protein có trên mỗi bản gel và màng, mỗi spot đều được xác định số thứ tự, vị trí, thể tích (tính theo độ lớn và độ đậm nhạt của spot) trên bản gel/màng. Phần mềm này còn cho phép xác định các spot protein tương ứng trên từng cặp bản gel. Dựa vào cường độ khối trung bình của từng spot (nomalized volume - được tính bằng thể tích của spot đó chia cho tổng thể tích các spot trên toàn bản gel nhân với 100) có thể chỉ ra điểm khác biệt giữa bản gel/màng mẫu bệnh so với bản gel/màng mẫu đối chứng (hình 4).
30
Sau khi phân tích hình ảnh, chúng tôi có thể chỉ ra các spot protein xuất hiện trên bản gel/màng này mà không xuất hiện trên bản gel/màng khác; các spot protein biểu hiện tăng, giảm ở các bản gel/màng khác nhau. Dựa vào kết quả này, chúng tôi xác định các spot protein ở các mẫu nghiên cứu có thể cắt ra khỏi bản gel phục vụ cho các phân tích tiếp theo. Đồng thời cũng xác định được các điểm protein tương ứng trên màng có tính kháng nguyên, đây chính là các protein kích thích sinh ra đáp ứng miễn dịch chống ung thư.
Hình 4. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều sử dụng phần mềm Phoretix 2.2.6. Cắt và thủy phân spot trên bản gel điện di hai chiều
Các spot protein quan tâm trên các bản gel điện di hai chiều được cắt ra khỏi bản gel, lúc này, phân tử protein nằm trong gel polyacrylamide liên kết với phân tử thuốc nhuộm Coomassie, do đó, để thu được tập hợp các mảnh peptide phục vụ cho phân tích khối phổ, cần loại bỏ chất màu Coomassie và phá vỡ cấu trúc không gian của phân tử protein giúp enzyme trypsin có thể hoạt động. Enzyme trypsin cắt phân tử protein tại các gốc Lysine (K) và Arginine (R) ở đầu C, và không cắt tại các vị trí này khi các gốc này được liên kết với Prolin (P). Khi đó, phân tử protein được cắt thành các mảnh peptide (6 - 20 acid amin) thích hợp cho phân tích khối phổ.
Quá trình tẩy màu spot và thuỷ phân protein thành các peptide sẵn sàng cho phân tích khối phổ, bao gồm các bước cụ thể như sau:
31 - Cắt các spot ra khỏi bản gel.
- Rửa các spot bằng nước MiniQ.
- Tẩy màu các spot đã nhuộm coomassie bằng dung dịch chứa ammonium bicarbonate (ABC) 50mM, acetonitrile (AcCN) 50%.
- Làm khô các spot bằng AcCN 100%.
- Nhỏ dung dịch trypsin vào các spot và ủ ở 37oC trong 4 giờ, khi đó, phân tử protein trong các spot sẽ bị thuỷ phân thành các peptide có thể đi ra khỏi gel polyacrylamide.
Các peptide trong dịch thủy phân sẽ được hấp phụ bằng Ziptip C18. Quy trình Ziptip được tiến hành theo các bước sau:
- Làm ướt Ziptip bằng dung dịch có Trifluoroacetic acid (TFA) 0,1% trong AcCN 70%.
- Cân bằng Ziptip bởi dung dịch TFA 0,1%.
- Hấp phụ peptide trong dịch thuỷ phân vào Ziptip. - Loại muối bằng dung dịch TFA 0,1%.
- Phản hấp phụ peptide ra khỏi Ziptip lên đĩa MS bằng dung dịch TFA 0,1% trong AcCN 70%.
- Cuối cùng, bổ sung lên đĩa MS dung dịch matrix (CHCA 10mg/ml trong TFA 0,05%, AcCN 50%).
2.2.7. Phân tích khối phổ và nhận dạng protein
Tiến hành phân tích khối phổ (MALDI-TOF MS) để xác định khối lượng của tập hợp các peptide thu được sau khi thủy phân mỗi spot protein. Phương pháp khối phổ (MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các hạt mang điện tích hay ion trong một điện trường hoặc từ trường nhất định. Nguồn MALDI được dùng trong phân tích các hợp chất cao phân tử dựa trên nguyên lý làm ion hóa và thăng
32
hoa mẫu peptide từ phức hợp với chất nền (matrix) ở dạng tinh thể qua tác động của các xung laser [1].
Mẫu peptide được phân tích song song với các mẫu chuẩn là hỗn hợp hai peptide: angiotensin II (Mw 1046,5423Da) và insulin B (Mw 3494,6513Da). Hỗn hợp peptide được trộn với chất nền CHCA, để khô và đưa vào máy phân tích khối phổ AXIMA - CRF PLUS (KRATOS ANALYTICAL, Anh). Các thông số hoạt động của máy khối phổ gồm:
- Nguồn laser: 55
- Profile: 30 profile cho một lần bắn - Khối lượng tối ưu: 2000Da
- Phổ khối lượng: 500 - 5000Da
Protein được nhận dạng theo phương pháp Peptide Mass Fingerprint (PMF). Theo phương pháp này, protein được xác định bằng việc so sánh khối lượng của các peptide thu được sau khi thủy phân với cơ sở dữ liệu lý thuyết sẵn có sử dụng phần mềm Mascot để tra cứu theo chế độ sau:
- Cơ sở dữ liệu: NCBInr - Phân loại: Homo sapiens
- Enzyme: Trypsin
- Các cải biến không thay đổi: Cacbamidomethyl (C) - Các cải biến thay đổi: Oxidation (M)
- Cho phép sai số: ± 1Da - Giá trị khối: MH+
33
Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. TÁCH CHIẾT PROTEIN TỪ MÔ GAN
Trong quá trình thực hiện đề tài này, chúng tôi tiến hành tách chiết protein từ mô gan ung thư và mô gan bình thường (mẫu đối chứng). Mẫu mô được cắt nhỏ, ngâm trong dịch chiết PBS 0,05M pH7,4 và đệm phá tế bào (Lysis) rồi thực hiện các bước ly tâm để thu lấy các phân đoạn dịch chiết protein. Kết quả tách chiết được kiểm tra bằng điện di SDS-PAGE (hình 5).
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
A. Dịch chiết mô gan bình thường B. Dịch chiết mô gan ung thư
Hình 5. Điện di kiểm tra các phân đoạn dịch chiết protein từ mô gan bình thường và mô gan ung thư trên gel polyacrylamide 10% có SDS
(Giếng 1: Dịch chiết PBS1; Giếng 2: Dịch chiết PBS2; Giếng 3: Dịch chiết Lysis1; Giếng 4: Dịch chiết Lysis2; Giếng 5: Dịch chiết Lysis3)
Trong điện di SDS-PAGE, protein được phân tách theo khối lượng phân tử, các protein có khối lượng phân tử khác nhau thì được hiện lên dưới dạng từng băng vạch khác nhau. Hiệu quả tách chiết protein được đánh giá thông qua thành phần và hàm lượng protein thể hiện bằng số lượng các băng và độ đậm nhạt của các băng protein. Khi nhuộm bản gel bằng thuốc nhuộm có chứa Coomassie, băng protein bắt màu thuốc nhuộm càng đậm chứng tỏ hàm lượng protein tại đó càng lớn. Số lượng băng trong một giếng điện di càng nhiều chứng tỏ thành phần protein của mẫu càng đa dạng phong phú.
34
Trong kết quả điện di kiểm tra dịch chiết protein từ mẫu mô gan (hình 5), chúng tôi thấy trong các giếng đã xuất hiện nhiều băng protein trải đều từ trên xuống dưới, chứng tỏ mẫu dịch chiết protein từ mô gan có thành phần protein đa dạng. Tuy nhiên, các phân đoạn dịch chiết protein mô gan có độ sạch khác nhau, ở các giếng 1, 3 (hình 5A) và giếng 1 (hình 5B), sự biểu hiện của các băng protein là chưa rõ ràng, hơn nữa, ở các giếng vẫn có hiện tượng kéo vệt dọc.
Do đó, chúng tôi tiến hành tủa mẫu dịch chiết thô bằng dung dịch acetone 100% theo tỉ lệ 1 thể tích mẫu và 4 thể tích dung dịch tủa ở -20oC nhằm tập trung protein có trong mẫu, đồng thời loại mỡ và các chất phi protein. Các dịch chiết sau khi tủa được hòa lại bằng đệm lysis và trộn lại với nhau tạo thành dịch chiết protein đầy đủ của mô gan dùng để tiến hành bước thí nghiệm tiếp theo.
3.2. PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU
3.2.1. Phân tách hệ protein mô gan trên bản gel diện di hai chiều
Cho đến nay, kỹ thuật điện di hai chiều (2-DE) đã trở thành một trong những công cụ phân tách protein được dùng rộng rãi trong các nghiên cứu về hệ protein. Kỹ thuật 2-DE cho phép phân tách các protein khác nhau 0,1 đơn vị pI (isoelectric point) và 1kDa về khối lượng phân tử [37]. Protein trong dịch chiết mô gan bình thường và mô gan ung thư cùng được phân tách bằng điện di hai chiều. Trên bản gel điện di, các protein trong mẫu được phân tách thành các spot protein riêng rẽ hoặc các dãy spot của một loại protein, đây là kết quả của việc cải biến protein, có thể do sự sắp xếp ARN hay biến đổi sau dịch mã, tạo ra các đồng phân có khối lượng phân tử tương tự nhau và điểm đẳng điện gần nhau.
Tuy hệ protein mô gan rất phức tạp, song hàm lượng của các protein trong gan khá đồng đều, do đó, các protein được phân tách khá tốt trên bản gel 2-DE (hình 6). Khi phân tách protein mô gan trên bản gel 2-DE sử dụng thanh strip dài 17cm trong khoảng pH 3 - 10 (hình 6A1, B1), kết quả điện di cho thấy các protein đã được phân tách rõ ràng thành các spot riêng rẽ nằm trải khắp bản gel và ít có những vùng tập trung các spot protein có hàm lượng cao bao trùm lên các spot protein
35
khác. Tuy nhiên, ở vùng giữa bản gel trong khoảng pH 4 - 7, mật độ các spot protein cao, do đó, chúng tôi tiếp tục tiến hành điện di hai chiều sử dụng thanh strip 7cm, pH 4 - 7 để phân tách protein trong khoảng pH này rõ ràng hơn (hình 6A2, B2).
A - Mô gan bình thường B - Mô gan ung thư
Hình 6. Phân tách protein mô gan của bệnh nhân 8460 trên bản gel điện di hai chiều
Chiều 1: Điện di đẳng điện sử dụng thanh IPG strip dài 17cm, pH 3 - 10 (A1 và B1); IPG strip dài 7cm, pH 4 - 7 (A2 và B2); Chiều 2: Điện di SDS-PAGE trên gel polyacrylamide 10%.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân tách được hệ protein mô gan ung thư và mô gan bình thường của 6 bệnh nhân HCC trên cả bản gel 2-DE sử dụng thanh strip dài 17cm, pH 3 - 10 và thanh strip dài 7cm, pH 4 - 7. Kết quả điện di phân tách protein mô gan của bệnh nhân HCC trên bản gel 2-DE được thể hiện trong hình 6 và phụ lục 2.
36
Bước đầu sử dụng phần mềm chuyên dụng phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều - Phoretix, chúng tôi đã xác định được tổng số spot được phân tách trên các bản gel 2-DE (bảng 5).
Bảng 5. Tổng số spot trên mỗi bản gel điện di hai chiều Mã bệnh
nhân
Bản gel 17cm Bản gel 7cm
Mô bình thường Mô ung thư Mô bình thường Mô ung thư
8261 272 spot 171 spot 75 spot 136 spot
8460 329 spot 288 spot 139 spot 123 spot
8935 258 spot 291 spot 53 spot 61 spot
8977 229 spot 254 spot 72 spot 91 spot
9242 275 spot 334 spot 108 spot 155 spot
10480 220 spot 268 spot 145 spot 141 spot
3.2.2. Phân tích biểu hiện của protein trên bản gel điện di hai chiều
Phần mềm chuyên dụng Phoretix cho phép so sánh sự biểu hiện của các protein thuộc mô gan ung thư so với mô gan bình thường thông qua sự biểu hiện của các spot trên các bản gel 2-DE. Phần mềm giúp xác định các spot tương ứng trên các bản gel, đưa ra giá trị cường độ khối trung bình của các spot. Ngoài ra, phần mềm còn đưa ra hình ảnh ba chiều (3-D) của các spot, trong đó, độ lớn của spot được thể hiện bằng bề rộng của đáy spot trên hình 3-D, độ đậm của spot được thể hiện bằng chiều cao của spot tính từ đáy lên đỉnh và độ sắc nét của spot nhuộm màu coomasie được thể hiện bằng độ nhọn của spot ấy trên hình ảnh 3-D (hình 7). Đây là cơ sở để so sánh mức độ biểu hiện của từng spot trên bản gel.
Căn cứ vào các thông số thu được khi phân tích hình ảnh bản gel 2-DE, chúng tôi có thể chỉ ra các spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô ung thư (+); các spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt trên bản gel mô bình thường (-); các spot biểu hiện tăng (↑) và các spot biểu hiện giảm (↓) ở bản gel mô ung thư so với bản gel mô bình thường (hình 8).
37
Hình 7. Hình ảnh 3-D của spot trên bản gel điện di hai chiều
A - Mô gan bình thường B - Mô gan ung thư
Hình 8. Minh họa các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô ung thư so với bản gel mô bình thường
Khi phân tích độc lập từng cặp bản gel, chúng tôi đã xác định được các spot protein biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư so với mô gan bình thường trên từng cặp bản gel 2-DE phân tách protein trong khoảng pH 3 - 10, dài 17cm (bảng 6) và phân tách protein trong khoảng pH 4 - 7, dài 7cm (bảng 7). Các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel 2-DE mẫu protein mô gan ung thư so với mô gan bình thường được minh họa ở hình 9.
38
- ô gan bình thường B - ô gan ung thư
Ghi chú: A1, B1 - Bản gel 2-DE dài 17cm, pH 3 - 10 A2, B2 - Bản gel 2-DE dài 7cm, pH 4 - 7
Hình 9. Các spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel 2-DE mẫu mô gan ung thư so với mô gan bình thường của bệnh nhân HCC mã 8935
A1 B
1
39
Bảng 6. Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư so với mô gan bình thường của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 17cm, pH 3 - 10
8261 8460 8935 8977 9242 10480 ↑ 31 16 51 23 21 39 ↓ 19 33 20 22 27 21 - 7 11 2 4 1 4 + 2 4 7 3 2 5 Tổng 59 64 80 52 51 69
Bảng 7. Thống kê các spot biểu hiện khác biệt giữa mô gan ung thư so với mô gan bình thường của từng bệnh nhân trên bản gel 2-DE 7cm, pH 4 - 7
8460 8935 8977 9242 10480 ↑ 6 17 18 11 16 ↓ 9 3 10 5 8 - 5 1 1 2 1 + 1 2 3 2 2 Tổng 21 23 32 20 27
Ghi chú: Spot protein biểu hiện tăng (↑); spot protein biểu hiện giảm (↓) ở bản gel mẫu
ung thư so với bản gel mô bình thường; spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mẫu ung thư (+); xuất hiện mờ nhạt hoặc không thấy trên bản gel mẫu mô ung thư (-).
Thống kê các spot protein biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô gan ung thư so với bản gel mô gan bình thường của cả 6 bệnh nhân HCC, chúng tôi nhận thấy có 52 spot khác biệt rõ ràng, xuất hiện trên các bản gel mô gan ung thư so với mô gan bình thường, bao gồm:
- 6 spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô ung thư - 5 spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô đối chứng - 23 spot biểu hiện tăng ở bản gel mô ung thư
40
Khi so sánh hình ảnh các bản gel điện di thu được trong nghiên cứu này với hình ảnh bản gel mô gan người trong cơ sở dữ liệu SWISS-2D-PAGE [43], chúng tôi nhận dạng được 13 protein tương ứng với 13 spot biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô gan ung thư so với bản gel mô gan bình thường (bảng 8).
Bảng 8. Danh sách các protein biểu hiện khác biệt trên bản gel của mô gan ung thư so với mô gan bình thường được xác định dựa trên cơ sở dữ liệu EMBL
STT Protein Yếu tố nhận dạng protein Cường độ khối trung bình Biểu hiện ĐC HCC 1 Alpha-1-antitrypsin (Alpha-1-protease inhibitor) (A1AT) P01009 0,0015 0,608 +
2 Protein disulfide-isomerase (PDIA1) P07237 0,738 0,078 ↓
3 Cellular tumor antigen p53 (p53) P04637 0,114 − −
4 Beta-actin, cytoplasmic 1 (ACTB) P60709 0,003 4,599 +
5 Haptoglobin (HPT) P00738 0,002 0,839 +
6 Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) P12004 0,0008 0,265 +
7 Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase (GAPDH/G3P) P04406 0,248 − −
8 Cathepsin D (CATD) P07339 0,0007 0,124 +
9 Enoyl-CoA hydratase, mitochondrial
(ECHM) P30084 0,0005 0,129 +
10 Superoxide dismutase [Mn],
mitochondrial (SODM) P04179 2,730 0,315 ↓
11 UMP-CMP kinase (KYC) P30085 0,306 0,014 ↓
12 Superoxide dismutase [Cu-Zn] (SODC) P00441 4,524 1,467 ↓
13 Glutamate dehydrogenase 1,
mitochondrial (GDH/ DHE3) P00367 0,686 − −
Ghi chú: ↑, protein biểu hiện tăng; ↓, protein biểu hiện giảm; -, protein không biểu