Nguyên tắc
Đồng nhất mẫu với dung dịch pha loãng. Từ dung dịch mẫu sau khi đồng nhất, tiến hành pha loãng thập phân thành nhiều nồng độ. Ở mỗi nồng độ thích hợp, chuyển 1ml dịch mẫu đã pha loãng vào đĩa Petri, sau đó trộn đều mẫu với môi trường thạch không chọn lọc.
Ủ mẫu trong điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ và thời gian theo yêu cầu. Sau đó, tính số vi sinh vật hiếu khí phát hiện được trên 1 gam mẫu.
Thiết bị và vật dụng
Tủ ủ 300C ± 10C
Bể điều nhiệt 450C ± 10C Máy sotlex
ống nghiệm
Môi trường PCA, nước muối sinh lý Đĩa Petri vô trùng, viết long kim
Micropipette 100 – 1.000 μl, đầu tip vô trùng Kéo, nẹp vô trùng để lấy mẫu
Cân điện tử Đèn cồn, cồn
Quy trình phân tích Chuẩn bị mẫu
Cân 1g mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý vô trùng đậy nắp ống nghiệm lại lắc đều và đem đi votex 30 giây. Đồng nhất mẫu trong khoảng 1 phút tùy theo đặc điểm của mẫu. Dịch mẫu sau đồng nhất có nồng độ là 10-1. Tiếp tục pha loãng thập phân đến nồng độ thích hợp.
Cấy mẫu
Chuyển 1ml ở mỗi nồng độ thích hợp vào đĩa Petri vô trùng (mỗi nồng độ thực hiện 2 đĩa). Tiếp theo cho vào mỗi đĩa khoảng 15 – 20 ml môi trường PCA ở nhiệt độ 450C. Trộn đều dịch mẫu và môi trường bằng cách di chuyển đĩa theo chiều kim đồng hồ, phải đảm bảo rằng mẫu và môi trường được trộn đều.
Ủ đĩa
Lật ngược các đĩa Petri, ủ trong tủ ủ 300C ± 10C trong thời gian 72 ± 6 giờ.
Chú ý: Bàn, dụng cụ thí nghiệm, tay phải sát trùng bằng cồn 70o , dụng cụ lấy mẫu kéo, kẹp phải sát trùng bằng cồn đốt, các dụng cụ sử dụng làm thí nghiệm cần được thanh trùng trước khi tiến hành thí nghiệm.
Tính kết quả
Nên chọn các đĩa có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 – 250 để đếm Trường hợp chung: Các đĩa có số khuẩn lạc thuộc khoảng 25 – 250. Số khuẩn lạc được tính trên một gam mẫu (ml mẫu) tính theo công thức sau: N = d n n V C ∗ ∗ +∑ ) 1 . 0 2 1 (
Trong đó:
∑C : là tổng số khuẩn lạc trên các đĩa ở các nồng độ, mỗi đĩa có số khuẩn lạc ≥ 25.
V: Thể tích mẫu cấy trên một đĩa (ml) n1: Số đĩa ở nồng độ thứ nhất
n2: Số đĩa ở nồng độ thứ hai
d: Nồng độ tương ứng với độ pha loãng thứ nhất Trường hợp tổng số khuẩn lạc ước tính
Nếu ở nồng độ ban đầu (10-1) hai đĩa có số khuẩn lạc nhỏ hơn 25: Tính số khuẩn lạc trung bình, y, của 2 đĩa. Kết quả được tính theo công thức N=y/d (d là nồng độ dịch mẫu ban đầu) và được biểu diễn là số vi sinh vật ước tính (CFU Est./g).
Nếu ở nồng độ ban đầu (10-1), hai đĩa không có khuẩn lạc: Kết quả được biểu diễn là < 1/d (d là nồng độ dịch mẫu ban đầu)
Nếu không có đĩa nào có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 – 250: Không có đĩa nào có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 25 – 250 nhưng ít nhất có một đĩa nhiều hơn 250 và một đĩa <25. kết quả được tính dựa vào số đĩa có số khuẩn lạc gần với 250.
Làm tròn kết quả: Kết quả số khuẩn lạc sau khi tính phải được làm tròn đến hai con số có nghĩa.
Báo cáo kết quả: Báo cáo số khuẩn lạc với đợn vị là cfu/g.