Tạo dòng và biểu hiện nisin tái tổhợp trong tếbào escherichia coli

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÌNH DƯƠNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỀ TÀI: Tạo dòng biểu nisin tái tổ hợp tế bào Escherichia coli Chủ nhiệm đề tài: LÊ THỊ KIM PHƯỢNG BÌNH DƯƠNG 7/2019 LỜI CẢM ƠN Đề tài thực hỗ trợ kinh phí trường Đại học Bình Dương hỗ trợ sở vật chất Phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học Phân tử - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh Tơi xin gởi lời cảm ơn đến PGS, TS Đặng Thị Phương Thảo cho phép tạo điều kiện cho tơi thực đề Phịng thí nghiệm Cơng nghệ sinh học Phân tử Tơi xin cảm ơn ThS Nguyễn Hiếu Nghĩa, bạn sinh viên Hương, Minh Phụng giúp tơi hồn thành đề tài Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Khoa Cơng nghệ Sinh học – Trường Đại học Bình Dương tạo điều kiện thời gian để thực đề tài Bình Dương, ngày 03 tháng 07 năm 2019 Chủ nhiệm đề tài Lê Thị Kim Phượng i MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Mục lục ii Danh sách từ viết tắt v Danh sách bảng vi Danh sách hình vii Tóm tắt viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Mục tiêu 1.3 Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Công nghệ protein tái tổ hợp 2.1.1 Giới thiệu sơ lược 2.1.2 Hệ thống Escherichia coli biểu protein tái tổ hợp 2.3 Tổng quan nisin 2.3.1 Sơ lược bacteriocin 2.3.2 Định nghĩa nisin 10 2.3.3 Phân loại nisin 11 2.3.4 Đặc điểm nisin 12 2.3.5 Sự sinh tổng hợp nisin 12 2.3.6 Cơ chế hoạt động nisin 14 2.3.7 Cơ chế miễn dịch tế bào chủ 16 2.3.8 Phương pháp đánh giá hoạt tính nisin 16 2.3.9 Ứng dụng nisin 17 ii 2.3.9.1 Trong bảo quản thực phẩm 17 2.3.9.2 Trong Y sinh 18 2.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng nisin 19 2.4.1 Nghiên cứu ứng dụng nisin Việt Nam 19 2.4.2 Nghiên cứu ứng dụng nisin giới 20 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Thời gian địa điểm thực 22 3.1.1 Thời gian 22 3.1.2 Địa điểm thực 22 3.2 Vật liệu 22 3.2.1 Chủng vi sinh 22 3.2.2 Plasmid 22 3.2.3 Các thang chuẩn 22 3.2.4 Môi trường 23 3.3 Thiết bị- dụng cụ - hóa chất 23 3.3.1 Thiết bị 23 3.3.2 Dụng cụ 24 3.3.3 Hóa chất 24 3.4 Phương pháp nghiên cứu 28 3.4.1 Tạo dòng tế bào E coli DH5α mang vector pET28a-nis 28 3.4.1.1 Thu nhận gen phương pháp polymerase chain reaction (PCR) 28 3.4.1.2 Thu nhận plasmid pET28a phương pháp SDS-kiềm 30 3.4.1.3 Thực cắt plasmid pET28a gen nis với enzyme cắt giới hạn 31 3.4.1.4 Thực phản ứng nối gen nis vào plasmid pET28a 32 3.4.1.5 Chuẩn bị tế bào E coli DH5α khả nạp 33 3.4.1.6 Biến nạp plasmid nối vào tế bào khả nạp E coli DH5α 33 3.4.1.7 Sàng lọc vector tái tổ hợp pET28a/nis 34 3.4.2 Tạo dòng E coli BL21 (DE3) mang vector pET28a/nis 35 iii 3.4.3 Kiểm tra biểu nisin tái tổ hợp dòng tế bào E coli BL21(DE3)/ pET28a-nis 35 3.4.3.1 Cảm ứng biểu nisin tái tổ hợp E coli BL21(DE3) IPTG 35 3.4.3.2 Thu nhận nisin tái tổ hợp phân đoạn khác sau cảm ứng với IPTG36 3.4.3.3 Kiểm tra diện nisin tái tổ hợp điện di tricine SDS-PAGE 37 3.4.3.4 Xác định biểu nisin tái tổ hợp phương pháp Western blot 38 3.4.4 Khảo sát biểu nisin tái tổ hợp theo nồng độ IPTG 38 3.4.5 Khảo sát biểu nisin tái tổ hợp theo thời gian cảm ứng 39 3.4.6 Thử hoạt tính nisin tái tổ hợp phương pháp khuếch tán lỗ thạch 40 3.4.7 Khảo sát hoạt tính nisin tái tổ hợp nhiệt độ pH khác 41 Chương KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 42 4.1 Kết tạo dòng E coli DH5α mang vector pET28a-nis 42 4.1.1 Thu nhận gen nis 42 4.1.2 Thu nhận plasmid pET28a 43 4.1.3 Kết biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E coli DH5α 44 4.1.4 Sàng lọc thể biến nạp mang vector tái tổ hợp pET28a-nis 45 4.2 Kết tạo dòng E coli BL21 (DE3) mang vector pET28a-nis 47 4.3 Kết kiểm tra biểu nisin tái tổ hợp 49 4.4 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ IPTG đến biểu nisin tái tổ hợp 51 4.5 Khảo sát ảnh hưởng IPTG đến biểu nisin tái tổ hợp theo thời gian 52 4.6 Kết khảo sát nhiệt độ ảnh hưởng đến độ bền hoạt tính nisin tái tổ hợp 53 4.7 Kết khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính nisin tái tổ hợp 56 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 5.1 Kết luận 57 5.2 Kiến nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ATP Adenosine Triphosphate CDC Center for Disease and Prevention cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid DTT 1,4-Dithiothreitol ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay EDTA Ethylenediamine Tetraacetic Acid FAO Food and Agriculture Organization FDA Food and Drug Administration GRAS Generally Regarded as Safe HNSCC Head and Neck Squamous Cell Carcinoma HRP Horseradish Peroxidase IPTG Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside LAB Lactic Acid Bacteria mRNA Messenger Ribonucleic Acid MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction SDS Sodium Dodecyl Sulfate TE Tris-EDTA VRE Vancomycin-Resistant Enterococci v DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Một số bacteriocin thương mại Bảng 2.2: Ứng dụng nisin bảo quản thực phẩm số nước 18 Bảng 4.1: Nồng độ gen nis sau tinh 42 Bảng 4.2: Kết đo nồng độ độ tinh plasmid pET28a 43 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Cấu trúc nisin A với amino acid biến đổi so với nisin cịn lại 11 Hình 2.2: Sự biến đổi tiền nisin 14 Hình 2.3: Cơ chế hoạt động nisin 15 Hình 2.4: Sự tạo phức nisin lipid II ngăn sinh tổng hợp vách tế bào 15 Hình 2.5: Nisin ức chế nảy mầm bào tử giai đoạn đầu 16 Hình 3.1: Sơ đồ bố trí lỗ thạch thử hoạt tính nisin tái tổ hợp 41 Hình 4.1: Kết thu gen nis 42 Hình 4.2: Kết điện di gel agarose 43 Hình 4.3: Kết biến nạp plasmid pET28a-nis vào tế bào E coli DH5α 45 Hình 4.4: Sơ đồ thiết kế vị trí gen nis chèn vào vector pET28a vị trí cặp mồi 46 Hình 4.5: Kết sàng lọc khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pET28a – nis 46 Hình 4.6: Kết biến nạp vector pET28a-nis vào tế bào E coli BL21 (DE3) 48 Hình 4.7: Kết PCR khuẩn lạc E coli BL21 (DE3) nghi ngờ mang pET28a-nis 48 Hình 4.8: Kết sàng lọc thể biến nạp E coli BL21 (DE3) mang plasmid pET28a 49 Hình 4.9: Kết cảm ứng biểu nisin tái tổ hợp 50 Hình 4.10 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ IPTG đến biểu nisin tái tổ hợp 51 Hình 4.11: Kết ảnh hưởng thời gian cảm ứng đến biểu nisin tái tổ hợp 53 Hình 4.12: Hoạt tính kháng nisin tái tổ hợp với chủng Staphylococcus aureus 54 Hình 4.13: Kết khảo sát hoạt tính nisin tái tổ hợp theo nhiệt độ 56 Hình 4.14: Kết khảo sát hoạt tính nisin tái tổ hợp pH khác 56 vii TĨM TẮT Nisin, peptide tự nhiên, có khả kháng vi sinh vật gây bệnh gây hỏng thực phẩm sử dụng bảo quản thực phẩm gần 50 quốc gia giới Với mong muốn chủ động sản xuất sử dụng nisin Việt Nam việc áp dụng kỹ thuật di truyền để sản xuất nisin tái tổ hợp biểu hệ thống tế bào E coli, chúng tơi thực đề tài “Tạo dịng biểu nisin tái tổ hợp tế bào E coli” Gen mã hóa cho nisin chúng tơi dịng hóa vào vector pET28a biểu thành cơng tế bào E coli BL21(DE3) với thời gian cảm ứng IPTG 0,5 mM Các kỹ thuật sử dụng dịng hóa biểu bao gồm: phản ứng PCR, phản ứng cắt-nối gen-vector với enzyme cắt giới hạn, hóa biến nạp, giải trình tự, điện di SDSPAGE, lai western blot Kết thử nghiệm hoạt tính dịch thô mang nisin tái tổ hợp phương pháp khuếch tán giếng thạch với chủng gây bệnh diện thực phẩm cho thấy nisin tái tổ hợp có khả kháng chủng Staphylococcus aureus Hoạt tính kháng khuẩn nisin tái tổ hợp trì sau tiến hành xử lý với nhiệt độ từ 30 đến 121 0C 15 phút Ngoài ra, dịch nisin thô pH khác từ pH - pH cho thấy có hoạt tính với đường kính vịng kháng từ - mm, cao pH 4, thấp pH 6, pH7 từ pH hoạt tính kháng hồn tồn Các kết thực nghiệm đề tài xem tiền đề cho nghiên cứu tiềm ứng dụng nisin tái tổ hợp bảo quản thực phẩm sau viii Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Vấn đề an tồn thực phẩm ln đóng vai trị quan trọng giữ gìn sức khỏe người, đảm bảo hạn chế khả bị bệnh, góp phần phát triển thể trạng giống nòi Hiện nay, trạng an toàn thực phẩm ngày trở nên nhiều người quan tâm, từ cấp quyền đến nhà hoạch định sách- điều lệ, nhà kinh doanh, sở sản xuất đặc biệt người tiêu dùng tình hình ngộ độc thực phẩm thực phẩm bẩn, hư hỏng, bảo quản không cách khơng suy giảm, ngược lại có chiều hướng gia tăng xảy với số lượng lớn người mắc phải cho vụ xã hội đại ngày nay, khơng nước mà cịn quốc tế Ở Việt Nam, số liệu thơng cáo năm 2008, có 2000 người nước bị ngộ độc thực phẩm, có ngộ độc vi sinh gây Năm 2015, xảy 150 vụ ngộ độc thực phẩm, làm hàng ngàn người mắc phải nhập viện; hay thời điểm tại, nhiều địa phương, quan chức liên tục phát bắt giữ nhiều thực phẩm bẩn, không đảm bảo an tồn thực phẩm Theo trung tâm phịng chống dịch bệnh Hoa Kỳ (Center for Disease and Prevention - CDC), năm có khoảng 47 triệu ca mắc bệnh thực phẩm bị nhiễm khuẩn, gây chết khoảng 3000 trường hợp; năm chi phí liên quan đến vụ ngộ độc trung bình 36 tỉ la Ngồi ra, q trình bảo quản sử dụng thực phẩm không hướng dẫn tạo điều kiện cho sinh vật gây bệnh nấm mốc, vi khuẩn công sinh sôi nảy nở làm giảm chất lượng thực phẩm tạo độc tố gây bệnh cho người tiêu dùng Việc dùng phương pháp bảo khác nhau, phụ gia - hóa học, kháng sinh - với liều lượng dư thừa, không quy định, không xuất xứ rõ ràng dễ dẫn đến nguy hại tiềm ẩn cho sức khỏe tính mạng người, làm tăng mối lo ngại cho người tiêu dùng Vì vậy, chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ tự nhiên, ứng dụng vào bảo quản thực phẩm, ngăn phát triển vi khuẩn gây hại, hạn chế vụ ngộ độc quan C-Mẫu kháng sinh ampicillin (4µg/ml) Tiếp sau đó, xử lý mẫu nisin thô với yếu tố pH nhiệt độ để kiểm tra liệu yếu tố có ảnh hưởng đến hoạt tính nisin tái tổ hợp tham gia vào bảo quản thực phẩm, trình chế biến bảo quản, thực phẩm nhiều bị yếu tố tác động Chúng tiến hành xử lý nisin thô dãy nhiệt độ từ 30 0C, 40 0C, … đến 100 C 121 0C 20 phút Với nhiệt độ từ 30 0C – 100 0C, sử dụng bể ổn nhiệt, với 121 0C sử dụng nồi hấp khử trùng Mẫu sau xử lý nhiệt độ thích hợp để nhiệt độ 0C 30 phút trước nhỏ vào giếng đĩa thạch Vi sinh vật thị Staphylococcus aureus Mẫu đối chứng (dịch tan từ sinh khối tế bào E coli BL21 (DE3)/pET28a) xử lý tương tự thực song song Kết thí nghiệm cho thấy nisin giữ hoạt tính kháng khuẩn tất nhiệt độ khảo sát, 121 0C, với đường kính kháng khuẩn dao động khoảng từ đến mm (hình 4.13) nhiệt độ cao từ 80 0C trở lên hoạt tính kháng có phần giảm nhẹ (từ mm mm mm) khác khơng có ý nghĩa mặt thống kê (dữ liệu khơng trình bày đây) lại phù hợp với ghi nhận Guerra cộng (2002) nisin ổn định cao nhiệt độ 100 0C sử dụng nisin thu từ môi trường lên men chủng Lactococcus lactis subsp lactis sử dụng nisaplin [106] Tuy nhiên, kết khảo sát chúng tơi có khác biệt so với kết nghiên cứu Herman cộng vào năm 2009, nisin khơng giữ hoạt tính kháng khuẩn sau xử lý 121 0C 20 phút; khả ức chế vi khuẩn xử lý nhiệt độ thấp (60, 80 100 0C) với dãy thời gian xử lý khác từ 10 phút đến 60 phút, theo quy tắc nhiệt độ cao xử lý với thời gian 100 0C xử lý 10, 20 30 phút; 60 0C xử lý mức thời gian 20, 40 60 phút [107] 55 mm mm 30 oC 40 oC 50 oC 60 oC 70 oC 80 oC 90 oC 100 oC 121 oC Nhiệt độ ( 0C) Hình 4.13: Kết khảo sát hoạt tính nisin tái tổ hợp theo nhiệt độ 4.7 Kết khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính nisin tái tổ hợp Với thí nghiệm khảo sát pH, xác định pH ban đầu dịch nisin thơ xử lí HCl 1N NaOH 1N để đạt giá trị từ pH đến pH 20 phút Các giá trị pH lựa chọn dựa vào nghiên cứu trước pH thực tế thực phẩm [34, 101, 106, 108] Dịch sau xử lý điều chỉnh pH ban đầu sau tiến hành thử hoạt tính phương pháp khuếch tán lỗ thạch khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ kết trình bày bảng 4.4 hình 4.14 Nisin tái tổ hợp thể hoạt tính tốt pH pH cao đường kính vịng ức chế nhỏ Hoạt tính nisin tái tổ hợp giảm từ pH pH trở nisin tái tổ hợp bị hoạt tính Kết này, có tương đồng với nghiên cứu Periago cộng (2001), tính kháng khuẩn nisin cao giảm từ pH trở xuống Periago and Moezelaar [109] mm 10 pH pH pH pH pH pH pH Hình 4.14: Kết khảo sát hoạt tính nisin tái tổ hợp pH khác 56 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Chúng tơi tạo dịng thành cơng chủng E coli DH5α/pET28a-nis cho mục đích cấu trúc lưu trữ vector mang gen nis, E coli BL21 (DE3)/pET28a-nis cho mục đích biểu nisin tái tổ hợp dùng bảo quản thực phẩm Trong nghiên cứu chúng tôi, nisin tái tổ hợp biểu dạng tan dạng tủa môi trường nuôi cấy E coli BL21 (DE3)/pET28a-nis cảm ứng IPTG với nồng độ thời gian cảm ứng tối ưu 0,5 mM Ngoài ra, để khẳng định tiềm ứng dụng nisin tái tổ hợp bảo quản thực phẩm, dịch nisin thô tiến hành thử nghiệm sơ cho thấy tính kháng với vi sinh vật gây bệnh thực phẩm Staphylococcus aureus Khả kháng Staphylococcus aureus nisin tái tổ hợp trì xử lý dãy nhiệt độ 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 121 0C 20 phút Đồng thời, tính kháng thể cao dịch nisin pH với đường kính vịng tan mm hoàn toàn pH 8, pH 5.2 Kiến nghị Với hạn chế thời gian kinh phí, kết khảo sát nisin tái tổ hợp dừng lại dịch thô với số lần lặp lại chưa nhiều Vì vậy, số nghiên cứu cần thực nhằm đánh giá xác thực tiềm ứng dụng nisin tái tổ hợp bảo quản thực phẩm: - Nghiên cứu phát triển quy trình tinh thu nhận nisin tái tổ hợp - Khảo sát hoạt tính nisin tái tổ hợp dạng tinh với điều kiện nhiệt độ pH khác tương thích với điều kiện chế biến bảo quản thực phẩm - Kiểm tra tính kháng khuẩn nisin tái tổ hợp tinh với vi sinh vật khác Listeria monocytogenes 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Anh Minor, T., et al., The Per Case and Total Annual Costs of Foodborne Illness in the United States Risk Analysis, 2015 35(6): p 1125-1139 Shin, J.M., et al., Biomedical applications of nisin Journal of applied microbiology, 2016 120(6): p 1449-1465 Demain, A.L and P Vaishnav, Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms Biotechnology advances, 2009 27(3): p 297-306 Pham, P.V., Chapter 19 - Medical Biotechnology: Techniques and Applications, in Omics Technologies and Bio-Engineering, D Barh and V Azevedo, Editors 2018, Academic Press p 449-469 Clark, D.P and N.J Pazdernik, Chapter 10 - Recombinant Proteins, in Biotechnology (Second Edition), D.P Clark and N.J Pazdernik, Editors 2016, Academic Cell: Boston p 335-363 Brondyk, W.H., Chapter 11 Selecting an Appropriate Method for Expressing a Recombinant Protein, in Methods in Enzymology, R.R Burgess and M.P Deutscher, Editors 2009, Academic Press p 131-147 Chen, R., Bacterial expression systems for recombinant protein production: E coli and beyond Biotechnology advances, 2012 30(5): p 1102-1107 Buchman, G.W., S Banerjee, and J.N Hansen, Structure, expression, and evolution of a gene encoding the precursor of nisin, a small protein antibiotic Journal of Biological Chemistry, 1988 263(31): p 16260-16266 Wingfield, P.T., Overview of the purification of recombinant proteins Current protocols in protein science, 2015 80: p 6.1.1-6.1.35 10 Baneyx, F., Recombinant protein expression in Escherichia coli Current opinion 11 in biotechnology, 1999 10(5): p 411-421 Rosano, G.L and E.A Ceccarelli, Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges Frontiers in microbiology, 2014 5: p 172 12 Vasilchenko, A.S and A.V Valyshev, Pore-forming bacteriocins: structural– functional relationships Archives of Microbiology, 2018 13 Chikindas, M.L., et al., Functions and emerging applications of bacteriocins Current Opinion in Biotechnology, 2018 49: p 23-28 14 Martínez, B., A Rodríguez, and E Suárez, Antimicrobial Peptides Produced by Bacteria: The Bacteriocins, in New Weapons to Control Bacterial Growth, T.G Villa and M Vinas, Editors 2016, Springer International Publishing: Cham p 1538 15 de Arauz, L.J., et al., Nisin biotechnological production and application: a review 16 Trends in Food Science & Technology, 2009 20(3): p 146-154 Ghanbari, M and M Jami, Lactic Acid Bacteria and Their Bacteriocins: A Promising Approach to Seafood Biopreservation 2013: INTECH Open Access Publisher 17 Jack, R.W., J.R Tagg, and B Ray, Bacteriocins of gram-positive bacteria Microbiological Reviews, 1995 59(2): p 171-200 18 Klaenhammer, T.R., Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria* FEMS Microbiology Reviews, 1993 12(1‐3): p 39-85 19 NETTLES, C.G and S.F BAREFOOT, Biochemical and Genetic Characteristics of Bacteriocins of Food-Associated Lactic Acid Bacteria Journal of Food 20 Protection, 1993 56(4): p 338-356 Bagde, P and N Vigneshwaran, Improving the stability of bacteriocin extracted from Enterococcus faecium by immobilization onto cellulose nanocrystals 21 Carbohydrate Polymers, 2019 209: p 172-180 Cleveland, J., et al., Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation International Journal of Food Microbiology, 2001 71(1): p 1-20 22 Mokoena, M.P., Lactic Acid Bacteria and Their Bacteriocins: Classification, Biosynthesis and Applications against Uropathogens: A Mini-Review Molecules, 2017 22(8): p 1255 23 Balciunas, E.M., et al., Novel biotechnological applications of bacteriocins: A review Food Control, 2013 32(1): p 134-142 24 and, M.A.R and J.E Wertz, Bacteriocins: Evolution, Ecology, and Application 25 Annual Review of Microbiology, 2002 56(1): p 117-137 Harris, L.J., H.P FLEMING, and T.R KLAENHAMMER, Sensitivity and resistance of Listeria monocytogenes ATCC 19115, Scott A, and UAL500 to nisin Journal of Food Protection, 1991 54(11): p 836-840 26 De Vuyst, L and F Leroy, Bacteriocins from Lactic Acid Bacteria: Production, Purification, and Food Applications Journal of Molecular Microbiology and 27 Biotechnology, 2007 13(4): p 194-199 Stevens, K.A., et al., Nisin treatment for inactivation of Salmonella species and other gram-negative bacteria Applied and Environmental Microbiology, 1991 28 57(12): p 3613-3615 Benmechernene, Z., et al., Recent patents on bacteriocins: food and biomedical applications Recent patents on DNA & gene sequences, 2013 7(1): p 66-73 29 DELVES-BROUGHTON, J., Nisin and its application as a food preservative 30 International Journal of Dairy Technology, 1990 43(3): p 73-76 Galié, S., et al., Biofilms in the Food Industry: Health Aspects and Control Methods Frontiers in Microbiology, 2018 9(898) 31 Delves-Broughton, J., et al., Applications of the bacteriocin, nisin Antonie van Leeuwenhoek, 1996 69(2): p 193-202 32 Piper, C., et al., Bioengineering of a Nisin A-producing Lactococcus lactis to create isogenic strains producing the natural variants Nisin F, Q and Z Microbial Biotechnology, 2011 4(3): p 375-382 33 Gharsallaoui, A., et al., Nisin as a food preservative: part 1: physicochemical properties, antimicrobial activity, and main uses Critical reviews in food science and nutrition, 2016 56(8): p 1262-1274 34 Hirsch, A., Growth and nisin production of a strain of Streptococcus lactis 35 Microbiology, 1951 5(1): p 208-221 Khusainov, R., G.N Moll, and O.P Kuipers, Identification of distinct nisin leader peptide regions that determine interactions with the modification enzymes NisB 36 and NisC FEBS Open Bio, 2013 3(1): p 237-242 Punyauppa-path, S., P Phumkhachorn, and P Rattanachaikunsopon, Nisin: production and mechanism of antimicrobial action International Journal of 37 Current Research and Review, 2015 7(2): p 47 McAuliffe, O., C Hill, and R.P Ross, Lantibiotics: structure, biosynthesis and mode of action FEMS Microbiology Reviews, 2001 25(3): p 285-308 38 Singh, T., G Pandove, and M Arora, Bacteriocins Journal of Biotechnological Science, 2013 1(2): p 73-75 39 Bauer, R and L.M.T Dicks, Mode of action of lipid II-targeting lantibiotics International Journal of Food Microbiology, 2005 101(2): p 201-216 40 Lubelski, J., et al., Biosynthesis, immunity, regulation, mode of action and engineering of the model lantibiotic nisin Cellular and molecular life sciences, 2008 65(3): p 455-476 41 Moll, G.N., W.N Konings, and A.J Driessen, Bacteriocins: mechanism of membrane insertion and pore formation Antonie van Leeuwenhoek, 1999 76(14): p 185-198 42 FALAHEE, M.B., et al., An enzyme immunoassay for nisin International Journal of Food Science & Technology, 1990 25(5): p 590-595 43 Falahee, M and M Adams, Cross‐reactivity of bacteriocins from lactic acid bacteria and lantibiotics in a nisin bioassay and ELISA Letters in applied microbiology, 1992 15(5): p 214-216 44 Waites, M and K Ogden, The estimation of nisin using atp‐bioluminometry 45 Journal of the Institute of Brewing, 1987 93(1): p 30-32 Wahlström, G and P Saris, A nisin bioassay based on bioluminescence Appl Environ Microbiol., 1999 65(8): p 3742-3745 46 Rose, N.L., P Sporns, and L.M McMullen, Detection of bacteriocins by matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry Appl Environ Microbiol., 1999 65(5): p 2238-2242 47 Siezen, R.J., et al., Lactic Acid Bacteria: Genetics, Metabolism and Applications: Proceedings of the seventh Symposium on lactic acid bacteria: genetics, metabolism and applications, 1–5 September 2002, Egmond aan Zee, the Netherlands Vol 82 2013: Springer Science & Business Media 48 Millette, M., et al., Capacity of human nisin-and pediocin-producing lactic acid bacteria to reduce intestinal colonization by vancomycin-resistant enterococci Appl Environ Microbiol., 2008 74(7): p 1997-2003 49 Severina, E., A Severin, and A Tomasz, Antibacterial efficacy of nisin against multidrug-resistant Gram-positive pathogens The Journal of antimicrobial chemotherapy, 1998 41(3): p 341-347 50 Ahire, J.J and L.M Dicks, Nisin incorporated with 2, 3-dihydroxybenzoic acid in nanofibers inhibits biofilm formation by a methicillin-resistant strain of Staphylococcus aureus Probiotics and antimicrobial proteins, 2015 7(1): p 5259 51 Okuda, K.-i., et al., Effects of bacteriocins on methicillin-resistant Staphylococcus aureus biofilm Antimicrobial agents and chemotherapy, 2013 57(11): p 55725579 52 Howell, T., et al., The effect of a mouthrinse based on nisin, a bacteriocin, on developing plaque and gingivitis in beagle dogs Journal of Clinical Periodontology, 1993 20(5): p 335-339 53 Tong, Z., et al., Nisin inhibits dental caries-associated microorganism in vitro 54 Peptides, 2010 31(11): p 2003-2008 Johnson, I., H Hayday, and G Colman, The effects of nisin on the microbial flora of the dental plaque of monkeys (Macaca fascicularis) Journal of Applied 55 Bacteriology, 1978 45(1): p 99-109 Shin, J.M., et al., Antimicrobial nisin acts against saliva derived multi-species biofilms without cytotoxicity to human oral cells Frontiers in microbiology, 2015 56 6: p 617 Tong, Z., et al., An in vitro study on the effects of nisin on the antibacterial activities of 18 antibiotics against Enterococcus faecalis PLoS One, 2014 9(2): p e89209 57 Turner, S., R Love, and K Lyons, An in‐vitro investigation of the antibacterial effect of nisin in root canals and canal wall radicular dentine International 58 endodontic journal, 2004 37(10): p 664-671 Le Lay, C., et al., Nisin Z inhibits the growth of Candida albicans and its transition from blastospore to hyphal form Journal of applied microbiology, 2008 59 105(5): p 1630-1639 Akerey, B., et al., In vitro efficacy of nisin Z against Candida albicans adhesion and transition following contact with normal human gingival cells Journal of 60 applied microbiology, 2009 107(4): p 1298-1307 De Kwaadsteniet, M., K Ten Doeschate, and L Dicks, Characterization of the structural gene encoding nisin F, a new lantibiotic produced by a Lactococcus lactis subsp lactis isolate from freshwater catfish (Clarias gariepinus) Appl Environ Microbiol., 2008 74(2): p 547-549 61 Wu, J., S Hu, and L Cao, Therapeutic effect of nisin Z on subclinical mastitis in lactating cows Antimicrobial agents and chemotherapy, 2007 51(9): p 3131- 62 3135 Fernández, L., et al., The bacteriocin nisin, an effective agent for the treatment of staphylococcal mastitis during lactation Journal of Human Lactation, 2008 63 24(3): p 311-316 Joo, N.E., et al., Nisin, an apoptogenic bacteriocin and food preservative, attenuates HNSCC tumorigenesis via CHAC Cancer medicine, 2012 1(3): p 295-305 64 Kamarajan, P., et al., Nisin ZP, a bacteriocin and food preservative, inhibits head and neck cancer tumorigenesis and prolongs survival PloS one, 2015 10(7): p e0131008 65 Preet, S., et al., Effect of nisin and doxorubicin on DMBA-induced skin carcinogenesis—a possible adjunct therapy Tumor biology, 2015 36(11): p 8301-8308 66 Rogers, L and E Whittier, Limiting factors in the lactic fermentation Journal of bacteriology, 1928 16(4): p 211 67 Whitehead, H.R., A substance inhibiting bacterial growth, produced by certain 68 strains of lactic streptococci Biochemical Journal, 1933 27(6): p 1793 Gross, E and J.L Morell, Structure of nisin Journal of the American Chemical Society, 1971 93(18): p 4634-4635 69 Henning, S., R Metz, and W.P Hammes, New aspects for the application of nisin to food products based on its mode of action International Journal of Food Microbiology, 1986 3(3): p 135-141 70 Liu, W and J.N Hansen, Some chemical and physical properties of nisin, a smallprotein antibiotic produced by Lactococcus lactis Appl Environ Microbiol., 1990 56(8): p 2551-2558 71 Hsu, S.-T.D., et al., The nisin–lipid II complex reveals a pyrophosphate cage that provides a blueprint for novel antibiotics Nature structural & molecular biology, 2004 11(10): p 963 72 Şimşek, Ö., et al., Immobilization of nisin producer Lactococcus lactis strains to chitin with surface-displayed chitin-binding domain Applied microbiology and biotechnology, 2013 97(10): p 4577-4587 73 Wilimowska-Pelc, A., et al., The use of gel-filtration for the isolation of pure nisin from commercial products Acta microbiologica Polonica Series A: Microbiologia generalis, 1976 8(1): p 71-77 74 Davies, E., H Bevis, and J Delves‐Broughton, The use of the bacteriocin, nisin, as a preservative in ricotta‐type cheeses to control the food‐borne pathogen Listeria monocytogenes Letters in Applied Microbiology, 1997 24(5): p 343346 75 Brul, S and P Coote, Preservative agents in foods: mode of action and microbial resistance mechanisms International journal of food microbiology, 1999 50(1-2): p 1-17 76 Pranoto, Y., S Rakshit, and V Salokhe, Enhancing antimicrobial activity of chitosan films by incorporating garlic oil, potassium sorbate and nisin LWTFood Science and Technology, 2005 38(8): p 859-865 77 Komitopoulou, E., et al., Alicyclobacillus acidoterrestris in fruit juices and its control by nisin International journal of food science & technology, 1999 34(1): p 81-85 78 Delves‐Broughton, J., G Williams, and S Wilkinson, The use of the bacteriocin, nisin, as a preservative in pasteurized liquid whole egg Letters in applied microbiology, 1992 15(4): p 133-136 79 Chollet, E., et al., Nisin preliminary study as a potential preservative for sliced ripened cheese: NaCl, fat and enzymes influence on nisin concentration and its antimicrobial activity Food Control, 2008 19(10): p 982-989 80 Pol, I and E Smid, Combined action of nisin and carvacrol on Bacillus cereus and Listeria monocytogenes Letters in Applied Microbiology, 1999 29(3): p 166-170 81 Kong, W and T Lu, Cloning and Optimization of a Nisin Biosynthesis Pathway for Bacteriocin Harvest ACS Synthetic Biology, 2014 3(7): p 439-445 82 He, F., Plasmid DNA extraction from E coli using alkaline Lysis method Biology Protocol, 2011 30: p 1-3 83 Teng, D., et al., Cloning of β-1, 3-1, 4-glucanase gene from Bacillus licheniformis EGW039 (CGMCC 0635) and its expression in Escherichia coli BL21 (DE3) Applied microbiology and biotechnology, 2006 72(4): p 705-712 84 Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 nature, 1970 227(5259): p 680 85 Wolf, C and W Gibbons, Improved method for quantification of the bacteriocin nisin Journal of applied bacteriology, 1996 80(4): p 453-457 86 Dumon-Seignovert, L., G Cariot, and L Vuillard, The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in BL21 (DE3), C41 (DE3), and C43 (DE3) Protein expression and purification, 2004 37(1): p 203206 87 Jeong, H., et al., Genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and 88 BL21 (DE3) Journal of molecular biology, 2009 394(4): p 644-652 Donovan, R.S., C.W Robinson, and B Glick, Optimizing inducer and culture conditions for expression of foreign proteins under the control of thelac promoter 89 Journal of industrial microbiology, 1996 16(3): p 145-154 Bentley, W.E., R.H Davis, and D.S Kompala, Dynamics of induced CAT expression in E coli Biotechnology and bioengineering, 1991 38(7): p 749-760 90 Wood, T.K and S.W Peretti, Effect of chemically‐induced, cloned‐gene expression on protein synthesis in E coli Biotechnology and bioengineering, 1991 38(4): p 397-412 91 Ozbudak, E.M., et al., Regulation of noise in the expression of a single gene Nature genetics, 2002 31(1): p 69 92 Harcum, S.W and W.E Bentley, Response dynamics of 26‐, 34‐, 39‐, 54‐, and 80‐ kDa proteases in induced cultures of recombinant Escherichia coli Biotechnology and bioengineering, 1993 42(6): p 675-685 93 Kosinski, M.J and J.E Bailey, Temperature and induction effects on the degradation rate of an abnormal β-galactosidase in Escherichia coli Journal of biotechnology, 1991 18(1-2): p 55-68 94 Studier, F.W and B.A Moffatt, Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes Journal of Molecular Biology, 1986 189(1): p 113-130 95 Wagner, S., et al., Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression Proceedings of the National Academy of Sciences, 2008 105(38): p 1437114376 96 Kwon, S.-K., et al., Comparative genomics and experimental evolution of Escherichia coli BL21(DE3) strains reveal the landscape of toxicity escape from 97 membrane protein overproduction Scientific Reports, 2015 5: p 16076 Drew, D., et al., Optimization of membrane protein overexpression and purification using GFP fusions Nature methods, 2006 3(4): p 303 98 Jhamb, K and D.K Sahoo, Production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli: effects of process conditions and chaperone co-expression on cell growth and production of xylanase Bioresource technology, 2012 123: p 135-143 99 Tolia, N.H and L Joshua-Tor, Strategies for protein coexpression in Escherichia coli Nature methods, 2006 3(1): p 55 100 Cabantous, S., T.C Terwilliger, and G.S Waldo, Protein tagging and detection with engineered self-assembling fragments of green fluorescent protein Nature biotechnology, 2005 23(1): p 102 101 Thomas, L.V and J Wimpenny, Investigation of the effect of combined variations in temperature, pH, and NaCl concentration on nisin inhibition of Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus Appl Environ Microbiol., 1996 62(6): p 2006-2012 102 COMA, V., et al., Antimicrobial edible packaging based on cellulosic ethers, fatty acids, and nisin incorporation to inhibit Listeria innocua and Staphylococcus aureus Journal of food protection, 2001 64(4): p 470-475 103 Chung, K.-T., J.S Dickson, and J.D Crouse, Effects of nisin on growth of bacteria attached to meat Appl Environ Microbiol., 1989 55(6): p 1329-1333 104 Van Staden, A., A Brand, and L Dicks, Nisin F‐loaded brushite bone cement prevented the growth of Staphylococcus aureus in vivo Journal of applied microbiology, 2012 112(4): p 831-840 105 Pongtharangkul, T and A Demirci, Evaluation of agar diffusion bioassay for nisin quantification Applied microbiology and biotechnology, 2004 65(3): p 268-272 106 Guerra, N.P and L Pastrana, Modelling the influence of pH on the kinetics of both nisin and pediocin production and characterization of their functional properties Process Biochemistry, 2002 37(9): p 1005-1015 107 Herman, C., et al., Effect of temperature, pH and NaCl on nisin activity against Lactobacillus fructivorans 2009 108 Gänzle, M.G., S Weber, and W.P Hammes, Effect of ecological factors on the inhibitory spectrum and activity of bacteriocins International Journal of Food Microbiology, 1999 46(3): p 207-217 109 Periago, P.M and R Moezelaar, Combined effect of nisin and carvacrol at different pH and temperature levels on the viability of different strains of Bacillus cereus International journal of food microbiology, 2001 68(1-2): p 141-148 110 Shin JM, Gwak JW, Kamarajan P, Fenno JC, Rickard AH, and Kapila YL Biomedical applications of nisin Journal of applied microbiology, 2016; 120(6): 1449-1465 111 Zendo T, Fukao M, Ueda K, Higuchi T, Nakayama J, and Sonomoto K Identification of the lantibiotic nisin Q, a new natural nisin variant produced by Lactococcus lactis 61-14 isolated from a river in Japan Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 2003; 67(7): 1616-1619 Tiếng Việt 112 TÚ, Hoa Thị Minh, et al Điều khiển lên men để tăng cường sinh tổng hợp Nisin vi khuẩn lactococcus lactis Tạp chí Khoa học Công Nghệ, 2007 46(2): 81-87 113 Thủy Trần Thanh, Tú Hoa Thị Minh, Phương Phạm Thị Thu, Việt Nguyễn Quốc, Mai Bùi Thị Thanh, Mấn Trần Đình, Bình Lê Thanh, Tác dụng kháng khuẩn màng polylactic acid-nisin, Tạp chí Khoa học Cơng Nghệ, 2013 51(6): 729735 114 Nguyễn, H N., Thái, N A., Nguyễn, Q H., Ngô, T C N., Nguyễn, T N., Trần, L T., & Đặng, T P T (2015) Tạo dòng biểu nisin bề mặt tế bào nấm Sacharomyces cerevisiae dung hợp với gen mã hố α-Agglutinin Tạp chí Công nghệ Sinh học, tập 13, số 2, tr 379-385 Internet 115 https://www.fishersci.co.uk/shop/products/fermentas-generuler-1kb-dnaladder/11833963 10 17 ngày 15 tháng 05 năm 2019 116 http://www.bio-rad.com/en-us/category/protein-ladders-standardsmarkers?ID=09507551-2848-4bd1-a3c1-650b4d41aa48, 10 17 ngày 15 tháng 05 năm 2019 PHỤ LỤC Kết khảo sát hoạt tính nisin tái tổ hợp theo nhiệt độ Nhiệt độ (0C) Hoạt tính nisin thơ Nhiệt độ (0C) 30 80 40 90 50 100 60 121 70 Staphylococcus aureus Hoạt tính nisin thơ Kết khảo sát hoạt tính nisin tái tổ hợp theo pH pH Hoạt tính nisin thơ pH Hoạt tính nisin thơ Các chủng vi sinh vật thị dùng đề tài Salmonella typhimurium Escherichia coli Pseudomonas fluorescens 8305 Lactobacillus subtilis Candida albicans Pseudomonas aeruginosa ... sử dụng nisin Việt Nam việc áp dụng kỹ thuật di truyền để sản xuất nisin tái tổ hợp biểu hệ thống tế bào E coli, thực đề tài ? ?Tạo dòng biểu nisin tái tổ hợp tế bào E coli? ?? Gen mã hóa cho nisin. .. 3.4.2 Tạo dòng E coli BL21 (DE3) mang vector pET28a/nis 35 iii 3.4.3 Kiểm tra biểu nisin tái tổ hợp dòng tế bào E coli BL21(DE3)/ pET28a-nis 35 3.4.3.1 Cảm ứng biểu nisin tái tổ hợp E coli BL21(DE3)... protein tái tổ hợp ngày phát triển ứng dụng nhiều đời sống Vì vậy, chúng tơi thực đề tài ? ?Tạo dòng biểu nisin tái tổ hợp tế bào Escherichia coli? ??, tạo tiền đề cho nghiên cứu sản xuất lượng lớn nisin