(Luận án tiến sĩ) nghiên cứu điều kiện lên men cordyceps sinensis tạo sinh khối giàu selen và khảo sát hoạt tính sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Lê Quốc Phong NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN Cordyceps sinensis TẠO SINH KHỐI GIÀU SELEN VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TSKH Ngô Kế Sương TP Hồ Chí Minh – Năm 2021 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành chương trình Nghiên cứu sinh Luận án Tiến sĩ, nhận quan tâm, chia sẻ, hỗ trợ nhiều thầy cô, anh chị, bạn bè khoá, đồng nghiệp đơn vị Xin trân trọng cám ơn PGS.TSKH Ngô Kế Sương, người thầy đáng kính ln động viên, hướng dẫn, góp ý kiến để tơi hồn thiện Luận án Trân trọng cám ơn TS Đinh Minh Hiệp hỗ trợ, giúp đỡ, chia sẻ suốt trình thực Luận án Xin trân trọng cám ơn thầy cô giáo Viện Sinh học Nhiệt đới, Học Viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh truyền đạt kiến thức, góp ý cho tơi suốt trình học tập thực đề tài Trân trọng cám ơn bạn nhóm nghiên cứu (TS Trần Minh Trang, ThS Nguyễn Tài Hoàng) dành nhiều tâm huyết, thời gian, hỗ trợ tơi hồn thành Luận án Trân trọng cám ơn Trung ương Đoàn TNCS Hồ Chí Minh, quan tơi cơng tác suốt thời gian thực Luận án, chia sẻ, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành chương trình học tập nghiên cứu Và cuối cùng, tơi xin dành tình cảm, biết ơn gia đình, người ln mong mỏi, âm thầm quan tâm, động viên, khích lệ để tơi hồn thành Luận án Trân trọng cám ơn MỞ ĐẦU Nấm Đông trùng Hạ thảo Cordyceps sinensis (đồng tên: Ophiocordyceps sinensis) loài nấm dược liệu quý sử dụng phổ biến Y học cổ truyền Trung Hoa Adenosine cordycepin hai dược chất quý xem chất thị hoạt tính sinh học quan trọng cho lồi nấm Các nghiên cứu đại chứng minh hoạt chất từ C sinensis có khả tăng cường miễn dịch, chống lão hóa, kháng viêm, kháng ung thư hỗ trợ điều trị bệnh liên quan đến phổi, thận, bệnh mạn tính khác đái tháo đường Hiện nay, C sinensis tự nhiên ngày việc khai thác mức kèm với biến đổi khí hậu Do đó, nghiên cứu ni cấy nhân tạo loại nấm quý nhận nhiều quan tâm vài thập kỷ qua Sử dụng môi trường bán rắn tạo thể môi trường lỏng nhân thu sinh khối loài nấm hai hướng tiếp cận phổ biến Trong đó, nhân ni sinh khối nấm mang tính ứng dụng thực tiễn cao cơng nghệ khơng sản xuất sinh khối nấm có thành phần hoạt chất tương tự tự nhiên, mà cịn triển khai sản xuất quy mơ cơng nghiệp thời gian ngắn với chi phí thấp so với kỹ thuật nuôi cấy thể Nhiều phương pháp nuôi cấy lỏng cải tiến thử nghiệm để nâng cao giá trị hoạt chất hoạt tính sinh học sinh khối nấm C sinensis Nghiên cứu ảnh hưởng nguyên tố khoáng vi lượng đến khả sản xuất sinh khối hợp chất thứ cấp chủ đề nhận nhiều quan tâm Trong đó, selen (Se) xem tiền chất đầy tiềm việc nâng cao dược tính sinh học nấm Đơng trùng Hạ thảo Hơn nữa, Se thành phần acid amin 21 gọi selenocysteine Nguyên tố tham gia vào cấu trúc nhiều enzyme kháng oxy hóa glutathione peroxidase, iodothyronine deiodinases thioredoxin reductase có chức sinh lý quan trọng kháng oxy hóa, kháng ung thư, tăng cường miễn dịch, ức chế HIV chống lão hóa Sự tham gia Se hệ thống miễn dịch kết hợp với số chế, bao gồm hoạt động gia tăng sản xuất tế bào miễn dịch NK (Natural killer cell), tế bào lympho T, lympho B, interferon C làm thụ thể có lực cao với interleukin-2, kích thích miễn dịch vắc-xin gây Bên cạnh đó, Se cịn có vai trị quan trọng chuyển hóa iốt, nghiên cứu nồng độ Se huyết trẻ bị bướu cổ thường thấp so với trẻ có kích thước tuyến giáp bình thường Như vậy, thiếu hụt Se tác động xấu đến sức khỏe Mặc dù nước ta có số dược liệu chứa Se như: tỏi, nấm linh chi nhàu hàm lượng Se loại dược liệu thường thấp không ổn định Từ năm 2003 – 2005, Bộ Y tế khuyến khích định hướng nghiên cứu sản xuất Se hữu có khả dụng sinh học cao Đề án “Chiến lược quốc gia dinh dưỡng giai đoạn 2011-2020 tầm nhìn đến năm 2030” (689/TH ngày 29/6/2011) nhấn mạnh phòng chống thiếu vi chất dinh dưỡng nay, có liên quan đến Se Chính lẽ đó, đề tài “Nghiên cứu điều kiện lên men Cordyceps sinensis tạo sinh khối giàu selen khảo sát hoạt tính sinh học” thực với: Mục tiêu tổng quát nghiên cứu: Sản xuất sinh khối nấm C sinensis giàu Se có hoạt tính sinh học cải thiện tạo nguồn Se có khả dụng sinh học cao Mục tiêu cụ thể nghiên cứu: (1) Xây dựng quy trình lên men sản xuất sinh khối nấm C sinensis giàu Se (2) Đánh giá số hoạt tính sinh học hoạt chất chứa Se từ sinh khối nấm C sinensis giàu Se Ý nghĩa khoa học thực tiễn: Ý nghĩa khoa học: Kết nghiên cứu cung cấp liệu khoa học ảnh hưởng Se đến sản xuất sinh khối hoạt tính sinh học sinh khối nấm Cordyceps sinensis, khả tích lũy Se sinh khối nấm Đồng thời, cơng trình giúp hiểu rõ thêm dạng Se hữu nấm Ý nghĩa thực tiễn: Kết tạo tiền đề sở kỹ thuật nhằm chuyển giao công nghệ để sản xuất ứng dụng sinh khối C sinensis giàu Se có hoạt tính sinh học cao việc phát triển sản phẩm thực phẩm bổ sung, bảo vệ sức khỏe CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Nấm Cordyceps sinensis 1.1.1 Đặc điểm, phân bố Cordyceps sinensis lồi nấm kí sinh ấu trùng lồi bướm đêm Thitarodes (Hepialus) armoricanus thuộc họ Hepialidae sống đất (hình 1.1) [1] Đây lồi nấm đặc hữu vùng cao nguyên Tây Tạng vùng đồng cỏ núi cao xung quanh khu vực dãy Himalaya Bhutan, Trung Quốc Nepal độ cao 3500-5000 m so với mực nước biển [2] Giá trị dược liệu loài nấm ghi nhận cách 2000 năm Trung Quốc nước phương Đông với tác dụng cải thiện chức gan thận, chữa đổ mồ hôi đêm, bệnh tiểu đường, máu nhiễm mỡ, bệnh tim, hồi phục sức khỏe, tăng tuổi thọ nâng cao thể trạng thể [3] [4] C sinensis ngồi tự nhiên Hình có nguồn gốc từ công bố Shrestha cộng (2013) [5] Đến năm 2007, Sung cộng tiến hành phân tích mối quan hệ 162 lồi Cordyceps việc phân tích - locus bao gồm ribosome tiểu phần nhỏ tiểu phần lớn (nrSSU dnrLSU), nhân tố kéo dài 1α (tef1), hai tiểu đơn vị lớn RNA polymerase II (rpb1 rpb2), β-tubulin (tub) ti thể ATP6 (atp6) xếp Cordyceps sinensis vào chi Ophiocordyceps đổi tên Ophiocordyceps sinensis [6], tên song C sinensis sử dụng phổ biến giới khoa học 1.1.2 Hoạt tính sinh học Với phát triển khoa học nay, người ta tìm hợp chất có nấm C sinensis Chính hoạt chất đóng vai trị quan trọng, định giá trị dược liệu loài nấm này, chúng gồm có: (i) Các hợp chất nitơ: adenine, adenosine, cordyceamides, cordycedipeptide, cordycepin, cordymin, cordysinin, dideoxyadenosine, guanine, guanosine, hypoxanthine, inosine, thymidine, thymine, uracil, uridine; (ii) Sterol: campesterol, cholesterol, daucosterol, ergosterol, sitisterol, stigmasterol; (iii) Polysaccharide dẫn xuất: cordysinocan, glucan, heteroglycan, mannitol, mannoglucan; (iv) Các protein, acid amin: cadaverine, carboline, cordymin, flazin, methylpyrimidine, perlolyrine, putrescine, spermidine, spermine, tryptophan; (v) Acid phenolic: acetovanillone, acid hydroxybenzoic, acid protocatechuic, acid salicylic, acid syringic, acid vanillic; (vi) Isoflavone: daidzein, genistein, glycitein, orobol; (vii) Acid béo: acid docosanoic, acid lauric, acid lignoceric, acid linoleic, acid myristic, acid oleic, acid palmitic, acid palmitoleic, acid pentadecanoic, acid stearic, acid succinic; (viii) Các vitamin, hợp chất bay loại khoáng Zn, Mg, Mn, Fe, Se, … [7] Y học đại chứng minh nấm Cordyceps có hoạt tính điều hịa miễn dịch, kháng oxy hóa, ức chế hình thành khối u, kháng kh̉n, kháng nấm, kháng di tìm số chế tác động lên đường sinh hóa thể Do việc sử dụng Cordyceps không giới hạn tăng cường sức khỏe, mà sử dụng phòng trị bệnh hô hấp, bệnh thận, gan, tim mạch, tăng lipid máu, rối loạn miễn dịch, hỗ trợ điều trị ung thư (bảng 1.1) Bảng 1.1 Hoạt tính sinh học nấm Cordyceps sinensis [8] Hoạt tính Cơ chế tác động Miễn dịch Tăng cường hàm lượng IgG, IgG1 IgG2b đặc hiệu ovalbumin Kích thích đại thực bào giải phóng IL-lβ, TNF-α INF-γ việc kích thích đường IkB–NF-kB Cảm ứng sinh trưởng tế bào T tiết IL-2, IL-6 IL-8 Kháng Giảm sản xuất NO, IL-12, TNF-α cytokine gây viêm Khóa viêm NF-kB thơng qua giảm biểu tín hiệu điều hịa kinase nội bào Kháng oxy Duy trì GPx hoạt động SOD tế bào Kích thích hoạt hóa hóa GPx, CAT SOD đồng thời giảm hàm lượng lactate dehydrogenase malondialdehyde Tăng điều hòa hoạt động superoxide dismutase chứa kẽm- đồng ức chế tích lũy lipofusin Gây Ức chế phosphoryl hóa tyrosine Bcl-2 Bcl-xL oncoprotein apoptosis Kích thích apoptosis thơng qua đường caspase/MAPK Tăng cường phosphoryl hóa biểu p53 Kháng Bằng đường miễn dịch kháng oxy hóa Kháng khối u khối u đường apoptosis Điều hòa đường tín hiệu đường tín hiệu MAPK có vai trị quan trọng q trình xâm lấn di cư tế bào ung thư, hoạt hóa đường tín hiệu PKC có tác dụng kháng khối u trực tiếp Ức chế tiết yếu tố liên quan đến xâm lấn di cư MMP-2, MMP-9 uPA Bảo vệ tim Ngăn chặn tích tụ cholesterol Ức chế hoạt tính cholesterol mạch esterase Hỗ trợ chữa bệnh đột quỵ thiếu máu cục thiếu oxy glucose Tách chuỗi Aα fibrinogen chuỗi α fibrin nhằm ngăn chặn huyết khối Bảo vệ Ức chế tăng trưởng tế bào mesangial thận thông qua thận đường PDGF/ERK TGF-β1/Smad Ức chế PDGF homodimer BB, nguyên nhân gây viêm sản xuất ROS Ức chế tăng sinh tế bào trung mô cầu thận thông qua đường PDGF/ERK TGFβ1/Smad Hoạt tính Cơ chế tác động Sức khỏe Kích thích tế bào Leydig tế bào hoàng thể hạt tiết steroid sinh sinh sản dục Tăng khả sản xuất E2, hormone quan trọng ảnh hưởng đến nỗn bào Hoạt hóa đường truyền tải tín hiệu PKA PKC kết hợp với Ars hoạt hóa đường cAMP-PKA-StAR để tạo steroidogenesis Phòng Điều hòa steroidogene buồng trứng để ngăn ngừa xương loãng ngừa loãng xương thiếu estrogen Giảm hoạt tính alkaline phosphatase huyết xương thanh, hoạt tính TRAP, hàm lượng CTX IFN-γ 1.2 Selen vai trò sinh học selen 1.2.1 Nguồn selen Se Jacob Berzelius Jöns phát năm 1817 chất thải trình khai thác quặng pyrit [9] Trong đất, Se tồn chủ yếu dạng selenite (SeO32−) selenate (SeO42−), lượng nhỏ dạng hữu hoạt động vi sinh vật thực vật tạo [9] Ngồi ra, Se cịn tồn nước phụ thuộc vào hàm lượng Se đất, đá nơi hoạt động vi sinh vật vi tảo nước [9] Như đa phần nguyên tố khác, Se tồn dạng vô hữu Ở dạng vơ cơ, Se dạng oxy hóa -2, 0, +4 +6 natri selenide, natri selenate, natri selenite,… Còn dạng hữu cơ, chúng gắn trực tiếp vào hợp chất hữu liên kết cộng hóa trị với mạch carbon selenomethionine, selenocysteine, dimethyl selenide, selenodiglutathione,… [9] [10] Hiện nay, người sử dụng Se hữu chủ yếu thông qua thực phẩm thường ngày rau, củ quả, thịt, trứng, sữa,… Ngoài ra, người thiếu Se bổ sung loại thuốc thực phẩm chức giàu Se Tùy khu vực địa lý mà thực phẩm nơi có hàm lượng Se khác Một số thực vật hành, tỏi, cải wasabi, nấm có khả tích lũy Se tốt với hàm lượng Se dao động từ 0,01 đến 0,55μg/g Đối với loài động vật nước cá, sò nguồn cung cấp Se đáng kể: cá biển (0,11 - 0,97μg/g), cá nước (0,18 - 0,68μg/g) Các sản phẩm thịt có hàm lượng Se khoảng 0,08 đến 0,73μg/g Trong sản phẩm sữa, hàm lượng Se tỉ lệ nghịch với hàm lượng chất béo dao động từ 0,01 đến 0,55μg/g [11] 1.2.2 Vai trò selen thể Hiện nay, 25 gen mã hóa seleno-protein xác định genome người Selenoprotein có chức khác nhau, bao gồm hoạt tính kháng oxy hóa, chức miễn dịch, trao đổi chất hormon tuyến giáp, vận chuyển cân nội môi Se trao đổi chất xương tim [9] [12] [13] Đối với hệ miễn dịch, nhiều nghiên cứu cho thấy diện lượng lớn Se lách, gan hạch bạch huyết Vì vậy, thiếu hụt Se gây ảnh hưởng xấu đến hệ miễn dịch Se kích thích hình thành kháng thể hoạt hóa tế bào T hỗ trợ với tế bào T gây độc tế bào NK Hơn nữa, Se có vai trò quan trọng điều trị bệnh nhân nhiễm HIV, số kết tích cực q trình điều trị làm chậm tiến triển bệnh, tăng tế bào T CD4+ giảm triệu chứng bệnh kèm tiêu chảy [12] [14] [15] Ở não, Se đóng vai trị quan trọng, thiếu hụt Se, mô não nơi ưu tiên nhận Se trước tiên Một số selenoprotein đặc trưng chứng minh có khả chống lại thối hóa thần kinh cách loại bỏ gốc tự (ROS) tăng cường kháng oxy hóa Trong đó, selenoprotein P có vai trò đặc biệt việc vận chuyển Se cách gắn chúng lên thụ thể bề mặt apoER2 [13] [14] Đối với vấn đề sinh sản nam giới, Se từ lâu công nhận cần thiết để sinh tổng hợp testosterone, hình thành phát triển bình thường tinh trùng Trong pha sớm q trình hình thành tinh trùng, GPx4 có vai trò peroxidase giúp bảo vệ tinh trùng khỏi tác nhân oxy hóa, đó, pha muộn, có vai trị hình thành phần giúp tinh trùng di động Đối với nam giới bị muộn vấn đề di chuyển tinh trùng, bổ sung Se 100μg/ngày giúp tăng khả hoạt động tinh trùng có khoảng 11% chúng có khả thụ tinh [14] [15] Đối với tuyến giáp, quan có hàm lượng Se cao thể Do đó, tuyến giáp khơng phụ thuộc vào iod mà cịn Se Se có vai trị khác tuyến giáp iodothyronine deiodinase (Dio1, Dio2) phụ thuộc Se, sản xuất hormon thyroid, triiodothyronine (T3) từ tiền chất chúng thyroxine (T4) [12] [15] Đối với bệnh tim mạch, thiếu hụt Se, peroxit lipid tích tụ máu gây tổn thương mạch máu mô Các nghiên cứu trước cho thấy Se có khả chống lại oxy hóa lipid giảm kết tụ tiểu cầu, kháng viêm từ giảm khả mắc bệnh tim mạch [12] [14] [15] Đối với ung thư, năm gần đây, nghiên cứu Se việc điều trị loại ung thư ngày phổ biến, mơ hình động vật, người hầu hết quan với nhiều loại ung thư khác phổi, bàng quang, đại trực tràng, gan, tuyến giáp, tuyến tiền liệt [12] [14] [15] Bên cạnh selenoprotein, Se cịn tích lũy vào polysaccharide Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào selenopolysaccharide từ vi khuẩn nấm (hình 1.2) GSSeGalNAc MeSeGalNAc MeSeGluNAc MeSeGalNH2 Một số cấu trúc seleno-đường [16] Một số thử nghiệm trước cho thấy selenopolysaccharide có khả kháng khối u như: Selenopolysaccharide (SeGLP-2B-1) từ nấm Ganoderma lucidum có khả cảm ứng tế bào MCF-7 theo đường apoptosis [17], seleno Sargassum fusiforme (Harv.) Setch polysaccharide (Se-SFPSI) - cải thiện hoạt tính CAT, SOD, GSH-Px chuột mang khối u S180 (dòng tế bào ung thư Sarcoma) sau 10 ngày thử nghiệm [18], selenopolysaccharide (ISPS) từ nấm C sinensis cho thấy khả kháng oxy hóa mạnh, giảm lượng glucose máu tăng cường khả miễn dịch mơ hình chuột [19] Năm 1988, Hội nghị Se sinh học y dược tổ chức Tubingen (Đức), Seko cộng cho thấy selenite phản ứng với glutathione H2Se tạo superoxide O2•- (hình 1.3) Kết gốc tự công gây tổn thương tế bào [20] 4GSH SeO32- GSSG GSH GSSeSG GSSG GSH GSSeH GSSG O2 H2Se Sơ đồ chuỗi phản ứng selente glutathione O2•Seo(1) 116 O sinensis đối chứng O sinensis giàu selen Cao chiết Nồng độ (µg/mL) 250 4000 2000 1000 Cao H2O 500 250 4000 2000 1000 Cao CPS 500 250 4000 2000 1000 IPS 500 250 4000 2000 EPS 1000 500 Giá trị ∆OD 0,640 ± 0,006 0,177 ± 0,012 0,373 ± 0,003 0,509 ± 0,007 0,566 ± 0,003 0,586 ± 0,007 0,235 ± 0,003 0,456 ± 0,004 0,563 ± 0,004 0,612 ± 0,004 0,638 ± 0,003 0,270 ± 0,004 0,451 ± 0,013 0,567 ± 0,000 0,625 ± 0,009 0,646 ± 0,006 0,288 ± 0,023 0,447 ± 0,017 0,554 ± 0,007 0,589 ± 0,022 Cao chiết Nồng độ (µg/mL) 250 4000 2000 1000 Cao H2O 500 250 4000 2000 1000 Cao CPS 500 250 4000 2000 1000 IPS 500 250 4000 2000 EPS 1000 500 Giá trị ∆OD 0,645 ± 0,005 0,192 ± 0,008 0,418 ± 0,003 0,513 ± 0,004 0,570 ± 0,003 0,590 ± 0,01 0,254 ± 0,004 0,448 ± 0,011 0,561 ± 0,003 0,616 ± 0,002 0,641 ± 0,004 0,259 ± 0,008 0,454 ± 0,007 0,569 ± 0,002 0,620 ± 0,005 0,641 ± 0,003 0,276 ± 0,011 0,434 ± 0,015 0,537 ± 0,010 0,596 ± 0,003 117 O sinensis đối chứng O sinensis giàu selen Cao chiết Nồng độ (µg/mL) Giá trị ∆OD 250 0,623 ± 0,009 Cao chiết Nồng độ (µg/mL) Giá trị ∆OD 250 0,627 ± 0,003 Phụ lục 14: Khảo sát hoạt tính bắt gốc tự DPPH O sinensis đối chứng O sinensis giàu selen Cao chiết Cao EtOH Cao PE Cao EtOAc Cao BuOH Nồng độ (µg/mL) Giá trị ∆OD Cao chiết Nồng Giá trị ∆OD độ (µg/mL) 2500 0,213 ± 0,008 2500 0,239 ± 0,002 1250 0,439 ± 0,009 1250 0,413 ± 0,013 625 0,516 ± 0,012 625 0,509 ± 0,004 312,5 0,567 ± 0,006 312,5 0,569 ± 0,008 0,609 ± 0,008 0,609 ± 0,008 5000 0,122 ± 0,002 5000 0,104 ± 0,004 2500 0,339 ± 0,006 2500 0,321 ± 0,005 1250 0,481 ± 0,008 1250 0,488 ± 0,003 625 0,561 ± 0,006 625 0,566 ± 0,004 0,633 ± 0,002 0,634 ± 0,003 2500 0,121 ± 0,003 2500 0,009 ± 0,001 1250 0,349 ± 0,005 1250 0,231 ± 0,008 625 0,441 ± 0,015 Cao EtOH Cao PE Cao EtOAc 625 0,457 ± 0,005 312,5 0,524 ± 0,011 312,5 0,523 ± 0,000 0,570 ± 0,011 0,591 ± 0,005 5000 0,129 ± 0,005 5000 0,207 ± 0,008 2500 0,370 ± 0,008 2500 0,370 ± 0,008 1250 0,508 ± 0,003 Cao BuOH 1250 0,502 ± 0,009 625 0,557 ± 0,004 625 0,563 ± 0,006 0,611 ± 0,006 0,611 ± 0,006 5000 0,254 ± 0,006 5000 0,302 ± 0,014 2500 0,439 ± 0,009 2500 0,474 ± 0,014 118 O sinensis đối chứng O sinensis giàu selen Cao chiết Nồng độ (µg/mL) Giá trị ∆OD Cao chiết Cao H2O 1250 0,532 ± 0,003 Cao H2O 625 Nồng Giá trị ∆OD độ (µg/mL) 1250 0,550 ± 0,011 0,580 ± 0,010 625 0,592 ± 0,005 0,629 ± 0,002 0,629 ± 0,002 Phụ lục 15: Khảo sát hoạt tính kháng viêm O sinensis đối chứng O sinensis giàu selen Cao chiết Cao EtOH Cao PE Cao EtOAc Cao BuOH Nồng độ (µg/mL) Giá trị ∆OD Cao chiết Nồng Giá trị ∆OD độ (µg/mL) 0 0,00 46,875 12,66 ± 2,06 93,75 13,20 ± 5,53 93,75 22,40 ± 0,76 187,5 23,40 ± 0,81 187,5 54,68 ± 15,37 375 26,86 ± 1,05 375 95,75 ± 1,42 750 40,92 ± 1,21 0,00 0 0,00 15,63 15,64 ± 0,81 93,75 20,65 ± 7,60 187,5 51,26 ± 4,89 Cao EtOH Cao PE 31,25 24,49 ± 1,91 62,50 48,99 ± 2,47 375 92,97 ± 3,32 125,00 95,59 ± 2,49 750 97,90 ± 1,52 0 0,00 93,75 7,73 ± 1,72 93,75 7,78 ± 5,52 375 26,04 ± 1,98 Cao EtOAc 187,5 22,51 ± 1,45 375 38,26 ± 8,54 750 50,12 ± 2,10 750 80,50 ± 0,87 1500 88,06 ± 1,58 0 0,00 62,5 -8,62 ± 1,24 93,75 4,97 125 0,00 ± 0,53 187,5 7,63 250 1,64 ± 1,27 375 11,45 500 5,23 ± 2,98 750 39,22 0 0,00 93,75 3,82 ± 1,99 93,75 8,37 Cao BuOH 119 O sinensis đối chứng O sinensis giàu selen Cao chiết Nồng độ (µg/mL) Cao H2O Cao CPS Cao IPS EPS Giá trị ∆OD Cao chiết 187,5 1,95 ± 2,04 Cao H2O 375 Nồng Giá trị ∆OD độ (µg/mL) 187,5 10,56 4,16 ± 1,23 375 14,44 750 -2,63 ± 1,81 750 38,56 0,00 5000 0,040 ± 0,010 93,75 8,02 ± 3,83 2500 0,388 ± 0,019 375 18,12 ± 1,17 1250 0,504 ± 0,000 1500 58,58 ± 1,79 625 0,563 ± 0,007 0 0,00 93,75 3,32 ± 0,2 93,75 7,26 187,5 10,09 ±0,08 187,5 12,95 375 13,54 ± 1,59 375 14,65 750 29,0 ± 1,8 750 43,70 1500 59,24 ± 7,23 0,00 0 0,00 93,75 2,50 ±1,16 93,75 11,47 375 5,24 ± 0,00 750 43,13 750 9,90 ± 1,20 1500 76,88 1500 20,74 ± 2,57 Cao CPS Phụ lục 16: Khả ức chế α-glucosidase cao chiết C sinensis O, sinensis giàu selen Cao chiết Cao EtOH Nồng độ (µg/mL) Giá trị ∆OD O, sinensis đối chứng Cao chiết Nồng Giá trị ∆OD độ (µg/mL) 0,53 0,968 50 0,58 50 0,958 500 0,55 500 1,003 5000 0,51 5000 1,001 Cao EtOH 120 O, sinensis đối chứng O, sinensis giàu selen Cao chiết Cao PE Cao EtOAc Cao BuOH Cao H2O Cao CPS Cao IPS EPS Nồng độ (µg/mL) Giá trị ∆OD Cao chiết Nồng Giá trị ∆OD độ (µg/mL) 0,59 0,968 50 0,61 50 0,840 500 0,59 500 0,744 5000 0,54 5000 0,737 0,59 0,888 50 0,58 50 0,889 500 0,56 500 0,873 5000 0,45 5000 0,774 0,542 0,764 50 0,544 50 0,767 500 0,539 500 0,751 5000 0,525 5000 0,743 0,542 0,762 50 0,541 50 0,784 500 0,530 500 0,797 5000 0,513 5000 0,781 0,595 0,636 50 0,591 50 0,631 500 0,566 500 0,605 5000 0,555 5000 0,593 0,824 0,936 50 0,780 50 0,906 500 0,725 500 0,940 5000 0,789 5000 0,926 0,549 0,945 50 0,534 50 0,952 500 0,543 500 0,903 5000 0,531 5000 0,974 Cao PE Cao EtOAc Cao BuOH Cao H2O Cao CPS Cao IPS EPS 121 Phụ lục 17: Môi trường nuôi khuẩn, môi trường thực kháng khuẩn Môi trường thực kháng khuẩn: Môi trường Muller Hinton Agar (MHA): Cao thịt 2g/L; Casein 17,5g/L;Tinh bột 1,5g/L; Agar 17g/L Phụ lục 18: Kết khảo sát khả ức chế XO cao chiết từ sinh khối nấm C sinensis nồng độ 4000µg/mL Khả ức chế XO (%) Mẫu C sinensis giàu Se C sinensis ĐC EtOH 28,94 ± 1,02 47,80 ± 1,09 PE 57,51 ± 1,93 25,27 ± 3,75 EtOAc 59,83 ± 0,21 64,18 ± 4,82 BuOH 54,70 ± 4,33 27,96 ± 6,51 Nước 26,80 ± 2,40 30,75 ± 4,29 CPS 33,79 ± 2,67 38,07 ± 4,01 IPS 33,07 ± 2,28 20,78 ± 0,82 EPS 39,12 ± 6,42 21,92 ± 3,53 Phụ lục 19: Kết thử độc tính cấp chuột C sinensis giàu Se CS-Se liều 2500mg/kg STT Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Giới Tính 21,2 21,5 22,7 24,3 25,3 26,2 27 Cái 22,1 23,7 24,7 26,4 27,8 28,7 29,5 Cái 21,5 22,1 23 23,6 24,2 24,8 25,6 Cái 19,3 19,9 19,2 20,7 21,7 22,5 23,2 Cái 20,7 21,3 21,7 23 23,1 24,2 25,1 Cái 19,1 19 18,6 19,6 20,3 21,5 22,3 Cái 23 24,4 23,9 26 27,2 28,6 29,2 Cái 122 CS-Se liều 2500mg/kg STT Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Giới Tính 19,3 19,3 20,8 22,3 24,2 24,2 26,5 Đực 19,4 20 20,7 21,5 23 24,3 25,9 Đực 10 20,6 20 21,3 22,7 23,3 24 26 Đực 11 21,5 20,6 21,4 24 25,8 26 26,2 Đực 12 22 22,5 23,2 25,1 26,2 27,8 28,7 Đực 13 22 22,8 22,8 24,6 25,6 26,8 28,1 Đực 14 21,6 21,3 21,2 23 24 25,9 27,6 Đực Phụ lục 20: Phần trăm gây độc tế bào (%) fibroblast Mẫu C sinensis giàu Se Phần trăm gây độc tế bào (%) fibroblast Lần Lần Lần TB ± ĐLC EtOH -10,38 -6,21 -10,38 -8,99 ± 2,41 PE -0,55 1,86 -4,92 -1,20 ± 3,44 EtOAc 9,84 9,94 5,46 8,41 ± 2,55 EtOH -2,66 6,48 6,60 3,48 ± 5,31 PE -1,60 6,02 6,13 3,52 ± 4,43 EtOAc 11,19 8,16 3,53 7,63 ± 3,86 BuOH 1,60 6,94 6,60 5,05 ± 2,99 C sinensis ĐC 123 Phụ lục 21: Phần trăm gây độc tế bào MCF-7 nồng độ khác Mẫu Mẫu Nồng độ Phần trăm gây độc tế bào MCF-7 (%) (µg/mL) Lần Lần Lần TB ± ĐLC 100 56,71 57,23 57,97 57,30 ± 0,64 50 57,65 59,51 53,72 56,96 ± 2,96 25 56,89 54,73 56,47 56,03 ± 1,15 10 25,00 21,45 26,62 24,36 ± 2,65 -1,39 2,68 -3,44 -0,72 ± 3,12 100 56,95 55,02 55,41 55,79 ± 1,02 10 45,98 48,41 48,38 47,59 ± 1,40 36,79 33,14 35,67 35,20 ± 1,87 -4,80 -0,93 -4,13 -3,29 ± 2,07 0,5 -5,18 -2,22 -7,30 -4,90 ± 2,55 100 62,07 61,64 61,08 61,60 ± 0,50 10 59,80 61,03 60,33 60,39 ± 0,62 59,54 61,38 60,88 60,60 ± 0,95 22,88 24,39 26,45 24,57 ± 1,79 0,5 -2,28 0,82 -2,89 -1,45 ± 1,99 50 55,65 60,04 52,76 56,15 ± 3,66 25 43,99 51,12 48,01 47,70 ± 3,58 C sinensis 10 11,39 17,14 26,87 18,46 ± 7,82 ĐC 11,75 10,85 11,83 11,48 ± 0,55 7,25 10,55 6,69 8,16 ± 2,08 50 55,64 57,41 56,09 56,38 ± 0,92 EtOH PE C sinensis giàu Se EtOAc EtOH PE 124 Mẫu Mẫu EtOAc BuOH Nồng độ Phần trăm gây độc tế bào MCF-7 (%) (µg/mL) Lần Lần Lần TB ± ĐLC 25 46,76 50,69 43,09 46,85 ± 3,80 10 39,14 44,91 34,43 39,49 ± 5,25 14,51 14,93 5,15 11,53 ± 5,53 5,85 0,23 3,40 3,16 ± 2,81 100 63,09 70,31 70,41 67,94 ± 4,20 50 61,18 64,60 69,43 65,07 ± 4,14 25 54,93 60,70 59,08 58,24 ± 2,97 10 25,16 31,22 25,52 27,30 ± 3,40 1,81 -3,77 -1,95 -1,30 ± 2,85 100 52,84 52,79 50,94 52,19 ± 1,08 50 29,85 31,60 20,73 27,39 ± 5,84 25 6,26 -0,69 -5,39 0,06 ± 5,86 10 -0,73 9,26 0,82 3,12 ± 5,38 4,18 11,57 -2,11 4,55 ± 6,85 125 Phụ lục 22: Phần trăm gây độc tế bào Jurkat nồng độ khác Phần trăm gây độc tế bào (%) Jurkat STT Ký hiệu Lần Lần Lần TB ± ĐLC ĐC -1,98 -1,00 7,00 1,34 ± 4,93 EPS 18,40 19,90 6,89 15,06 ± 7,12 IPS -1,35 -1,65 -5,88 -2,96 ± 2,53 EtOH 37,47 38,23 32,32 36,01 ± 3,21 PE 40,08 42,86 30,67 37,87 ± 6,39 EtOAc 35,19 41,54 34,62 37,11 ± 3,84 BuOH 3,54 5,95 14,05 7,85 ± 5,50 Nước -3,29 -4,71 -10,65 -6,22 ± 3,91 CPS -1,43 2,56 -2,94 -0,60 ± 2,84 EPS 23,39 25,90 27,77 25,69 ± 2,20 IPS -4,13 8,97 -7,60 -0,92 ± 8,74 EtOH 23,70 32,54 27,64 27,96 ± 4,42 PE 21,16 39,71 32,87 31,25 ± 9,38 EtOAc 36,93 40,14 31,69 36,25 ± 4,27 BuOH -10,79 5,55 3,65 -0,53 ± 8,94 Nước 0,41 -3,28 -2,18 -1,68 ± 1,89 CPS -21,80 -7,09 -7,31 -12,06 ± 8,43 C sinensis giàu Se C sinensis ĐC 126 Phụ lục 23: Mật độ tế bào ung thư sau xử lý với mẫu cao từ C sinensis ĐC 48 (200x) A: CPT 0,05mgSe/L; B: Cao EtOH 100mgSe/L; C: Cao PE100mgSe/L; D: Cao EtOAc100mgSe/L; E: Cao BuOH100mgSe/L Phụ lục 24: Sự phát triển nấm Cordyceps sinensis môi trường PGA bổ sung selenourea từ đến 40 mgSe/L thời điểm 15 ngày 127 Phụ lục 25: Sắc kí đồ selen nguyên dạng SeCysa 128 Phụ lục 26: Sắc kí đồ phân tích selen nguyên dạng mẫu sinh khối nấm C sinensis C sinensis theo PP1 Sắc kí đồ SeMet, SeCys2, Se4+, Se6+, SeMetCys C sinensis theo PP1 Sắc kí đồ SeCysa 129 C sinensis theo PP2 Sắc kí đồ SeMet, SeCys2, Se4+, Se6+, SeMetCys C sinensis theo PP2 Sắc kí đồ SeCysa 130 Phụ lục 27: Kết phân tích thành phần dinh dưỡng, hoạt chất tiêu ATTP ... ? ?Nghiên cứu điều kiện lên men Cordyceps sinensis tạo sinh khối giàu selen khảo sát hoạt tính sinh học? ?? thực với: Mục tiêu tổng quát nghiên cứu: Sản xuất sinh khối nấm C sinensis giàu Se có hoạt. .. hoạt tính sinh học cải thiện tạo nguồn Se có khả dụng sinh học cao Mục tiêu cụ thể nghiên cứu: (1) Xây dựng quy trình lên men sản xuất sinh khối nấm C sinensis giàu Se (2) Đánh giá số hoạt tính sinh. .. xuất sinh khối nấm Cordyceps sinensis giàu selen Nội dung 3: Đánh giá hoạt tính sinh học sinh khối nấm Cordyceps sinensis giàu selen 2.3 Địa điểm thời gian thực 2.3.1 Địa điểm thực hiện: Viện Sinh