Nghiên cứu điều chế cao đặc giàu apigenin và luteolin từ quả cây cần tây (apium graveolens l ) sử dụng hệ dung môi eutectic

DANH MỤC CÁC BẢNG hiệu 1 3.1 Tóm tắt kết quả thẩm định phương pháp định lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết quả cần tây 24 2 3.2 Kết quả khảo sát khả năng tạo hệ dung môi eut

SỬ DỤNG HỆ DUNG MÔI EUTECTIC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2021

SỬ DỤNG HỆ DUNG MÔI EUTECTIC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS

Nguyễn Thu Hằng – Trưởng bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội Cô

không chỉ là người mang lại tri thức, còn là người đã truyền cho tôi niềm đam mê với nghiên cứu dược liệu, người đã dành rất nhiều thời gian, tâm huyết để chỉ bảo, hướng dẫn, động viên và khích lệ tôi trong suốt quá trình làm khóa luận tốt nghiệp

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới ThS Nguyễn Văn Phương –

Giảng viên bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy đã luôn

đồng hành, quan tâm, hướng dẫn, chia sẻ kiến thức, kỹ năng và kinh nghiệm sống cho tôi trong suốt quãng thời gian học tập và nghiên cứu khoa học tại bộ môn

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị đang công tác tại bộ môn Dược Liệu đã tạo điều kiện giúp tôi trong quá trình thực hiện khóa luận, cảm ơn các bạn, các

em sinh viên đang học tập và nghiên cứu khoa học tại bộ môn đã ở bên giúp đỡ, chia sẻ, động viên tôi những lúc khó khăn nhất, giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu Nhà trường, các phòng ban cùng toàn thể thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian qua

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đình, bạn bè, người thân đã luôn ủng hộ, cổ vũ, là nguồn động lực to lớn để tôi học tập, rèn luyện và nghiên cứu tại trường Đại học Dược Hà Nội

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 5 tháng 5 năm 2021

Sinh viên

Triệu Thị Tú Uyên

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về quả cần tây 3

1.1.1 Thành phần hóa học 3

1.1.2 Tác dụng sinh học 4

1.2 Tổng quan về dung môi eutectic 6

1.2.1 Định nghĩa 6

1.2.2 Thành phần 6

1.2.3 Phân loại 7

1.2.4 Phương pháp điều chế 8

1.2.5 Tính chất 9

1.2.6 Ưu điểm và nhược điểm 12

1.2.7 Ứng dụng 13

1.2.8 Một số nghiên cứu ứng dụng hệ dung môi eutectic trong lĩnh vực chiết xuất 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên liệu, thiết bị 17

2.1.1 Nguyên liệu 17

2.1.2 Hóa chất, thiết bị và phần mềm 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.2.1 Nội dung 1: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết quả cần tây 18

2.2.2 Nội dung 2: Khảo sát và lựa chọn hệ dung môi eutectic 18

2.2.3 Nội dung 3: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao đặc giàu apigenin và luteolin từ quả cần tây 18

2.2.4 Nội dung 4: Khảo sát và lựa chọn các điều kiện tối ưu cho quá trình chiết xuất cao đặc giàu apigenin và luteolin từ quả cần tây 18

2.2.5 Nội dung 5: Khảo sát và lựa chọn phương pháp điều chế cao đặc giàu apigenin và luteolin từ dịch chiết quả cần tây trong DES 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Quy trình chiết xuất dự kiến 19

2.3.2 Phương pháp định lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết quả cần tây 19 2.3.3 Phương pháp khảo sát và lựa chọn hệ dung môi eutectic 20

2.3.4 Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất 20

2.3.5 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và lựa chọn các điều kiện tối ưu cho quá trình chiết xuất 21

2.3.6 Lựa chọn phương pháp điều chế cao đặc quả cần tây từ dịch chiết DES 22

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết quả cần tây 24

3.1.1 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc 24

3.1.2 Chuẩn bị dung dịch thử 24

3.1.3 Thẩm định phương pháp định lượng 24

3.2 Kết quả khảo sát và lựa chọn hệ dung môi eutectic 25

3.3 Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất 28

3.3.1 Thời gian chiết xuất 28

3.3.2 Nhiệt độ chiết xuất 30

3.3.3 Hàm lượng nước trong hệ dung môi 31

3.4 Kết quả khảo sát và lựa chọn các điều kiện tối ưu 32

3.4.1 Thiết kế thí nghiệm và kết quả thực nghiệm 32

3.4.2 Kết quả tối ưu hóa quá trình chiết xuất 33

3.5 Kết quả khảo sát và lựa chọn phương pháp điều chế cao đặc từ dịch chiết quả cần tây trong DES 38

3.5.1 Cách tiến hành 38

3.5.2 Kết quả 38

3.6 Bàn luận 40

3.6.1 Ý nghĩa của nghiên cứu 40

3.6.2 Triển vọng ứng dụng của hệ DES trong chiết xuất 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ANOVA Phương pháp phân tích phương sai (Analysis of variance)

AOAC Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thống

CCD Mô hình phức hợp trung tâm (Central composite design)

DES Dung môi eutectic (Deep Eutectic Solvent)

DMSO Dimethyl sulfoxid

HBA Chất nhận liên kết hydro (Hydrogen Bond Acceptor)

HBD Chất cho liên kết hydro (Hydrogen Bond Donor)

HPLC Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

(High Performance Liquid Chromatography)

IL-10 Interleukin 10

IL-1β Interleukin 1β

IL-6 Interleukin 6

kl/kl Tỉ lệ khối lượng/khối lượng

MLR Hồi quy tuyển tính đa biến (Multi linear regression)

NMDA N-methyl-D-aspartat

OFAT Phương pháp thay đổi một yếu tố (One factor at a time)

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

RSM Phương pháp bề mặt đáp ứng (Response surface methodology)

DANH MỤC CÁC BẢNG

hiệu

1 3.1 Tóm tắt kết quả thẩm định phương pháp định lượng apigenin

và luteolin trong dịch chiết quả cần tây 24

2 3.2 Kết quả khảo sát khả năng tạo hệ dung môi eutectic 26

3 3.3 Kết quả khảo sát khả năng chiết xuất của các dung môi 27

4 3.4 Thiết kế thí nghiệm và kết quả thực nghiệm 32

5 3.5

Kết quả phân tích phương sai ANOVA của mô hình biểu thị mối tương quan giữa hàm lượng apigenin trong dịch chiết với các biến đầu vào

35

6 3.6

Kết quả phân tích phương sai ANOVA của mô hình biểu thị mối tương quan giữa hàm lượng luteolin trong dịch chiết với các biến đầu vào

36

7 3.7 Kết quả kiểm định mô hình bằng thực nghiệm 37

8 3.8 Kết quả định lượng apigenin và luteolin trong cao cần tây 39

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

hiệu

1 1.1 Cấu trúc hóa học của apigenin và luteolin 3

2 2.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất cao cần tây 19

3 3.1 Hàm lượng apigenin và hàm lượng luteolin trong các mẫu dịch

6 3.4 Kết quả khảo sát hàm lượng nước trong hệ dung môi 31

7 3.5

Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa hàm lượng apigenin trong dịch chiết và hàm lượng luteolin trong dịch chiết với các biến đầu vào

34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cần tây (Apium graveolens L.) là loài cây được trồng phổ biến tại Việt Nam Quả

cần tây (hay còn gọi là hạt cần tây) được đánh giá là một dược liệu tiềm năng để phòng

và điều trị bệnh gút với các tác dụng hạ acid uric [33], ức chế enzym xanthin oxidase [33], chống viêm [51] và giảm đau [50] Flavonoid là một trong những thành phần chính, đồng thời cũng là nhóm hợp chất có liên quan đến tác dụng hạ acid uric, chống viêm và giảm đau của dược liệu này [32] Trong số các flavonoid có trong quả cần tây, hai hợp chất apigenin và luteolin đã được chứng minh tác dụng hạ acid uric và ức chế xanthin oxidase trên thực nghiệm [19], [26], [35] Vì vậy, việc nghiên cứu chiết xuất cao đặc giàu apigenin và luteolin từ quả cần tây là cần thiết để từ đó phát triển các sản phẩm phòng và điều trị bệnh gút từ dược liệu này

Trong các quy trình chiết xuất flavonoid từ quả cần tây đã công bố trước đây, các dung môi hữu cơ như ethanol, hexan, methanol thường được sử dụng [31], [51] Đây cũng là các dung môi chính hay được dùng để chiết xuất phần lớn các hợp chất có hoạt tính sinh học từ dược liệu Tuy nhiên, việc sử dụng các dung môi hữu cơ này ở quy mô lớn có một số hạn chế như dễ cháy nổ, gây ô nhiễm môi trường và hủy hoại nền sinh thái Đặc biệt, việc tiếp xúc với dung môi hữu cơ trong thời gian dài có thể gây nhiễm độc hệ thần kinh, ung thư, vô sinh, mù lòa, gây độc cho gan, thận, suy hô hấp…cho người lao động [28] Vì vậy, cần thiết phải tìm ra một dung môi thay thế nhằm khắc phục được các nhược điểm trên của dung môi hữu cơ

Trong những năm gần đây, dung môi eutectic (DES - Deep Eutectic Solvent) đã

thu hút được rất nhiều sự quan tâm như một dung môi xanh, thân thiện với môi trường

và là một giải pháp thay thế cho các dung môi hữu cơ truyền thống với các ưu điểm nổi bật như: an toàn, dễ tổng hợp, dễ phân hủy, có thể dễ dàng tái chế với khả năng chiết xuất chọn lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học [34], [37], [54], [55] Tuy nhiên, các quy trình chiết xuất sử dụng hệ dung môi eutectic cũng như các nghiên cứu về điều kiện chiết xuất tối ưu, phương pháp loại dung môi hiện nay vẫn còn rất hạn chế Đặc biệt, chưa có nghiên cứu nào ứng dụng hệ dung môi DES trong việc chiết xuất cao đặc giàu apigenin và luteolin từ quả cần tây

Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu điều chế cao đặc giàu apigenin và luteolin từ quả

cây cần tây (Apium graveolens L.) sử dụng hệ dung môi eutectic” được thực hiện với

2 mục tiêu:

1 Xây dựng quy trình chiết xuất dịch chiết giàu apigenin và luteolin từ quả cần tây sử dụng hệ dung môi eutectic

2 Xây dựng quy trình điều chế cao đặc giàu apigenin và luteolin từ dịch chiết quả cần tây trong hệ dung môi eutectic

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về quả cần tây

Dược liệu là quả chín đã phơi hay sấy khô của cây cần tây (Apium graveolens

L.), họ Cần (Apiaceae) [1]

1.1.1 Thành phần hóa học

Quả cần tây chứa nhiều thành phần như: flavonoid, tinh dầu, coumarin, chất béo, carotenoid [63] Trong đó, các hợp chất flavonoid, tinh dầu và coumarin là thành phần hóa học chính và được quan tâm nhiều nhất hiện nay [3], [43]

1.1.1.1 Flavonoid

Các hợp chất flavonoid trong quả cần tây chủ yếu là apigenin, luteolin và các dẫn xuất glycosid của chúng Đây là thành phần hóa học chính và đồng thời là nhóm chất chuyển hóa thứ cấp quan trọng nhất của quả cần tây với nhiều tác dụng sinh học quan trọng như kháng khuẩn, chống viêm, chống oxy hóa, chống khối u và bảo vệ tim mạch [32]

Đặc biệt, nhóm hợp chất flavonoid đã được chứng minh có liên quan đến tác dụng hạ acid uric của quả cần tây Trong đó, tác dụng hạ acid uric và ức chế xanthin oxidase của apigenin và luteolin đã được xác nhận trong nhiều nghiên cứu [19], [26],

[35] Cấu trúc hóa học của apigenin và luteolin được trình bày ở hình 1.1

(31,15%), β-selinen (22,28%), p-cresyl iso-valerat (14,94%), α-2-propenyl benzen methanol (9,87%), β-myrcen (4,32%), α-selinen (4,32%) và một số hợp chất khác [32],

[38]

1.1.1.3 Coumarin

Theo thống kê, hiện có 20 hợp chất furanocoumarin đã được phát hiện trong quả cần tây [6], [7], [10], [31], điển hình trong số đó là: umbelliferon [41], psoralen [14], [31], bergapten [14], [64], xanthotoxin [14], [64] và isopimpinellin [11]

1.1.2 Tác dụng sinh học

1.1.2.1 Tác dụng hạ acid uric và ức chế xanthin oxidase

Cao chiết ethanol từ quả cần tây thể hiện tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase

(XO) in vitro ở 2 nồng độ 50 µg/ml và 100 µg/ml Bên cạnh đó, phân đoạn cloroform

và ethyl acetat từ quả cần tây thể hiện tác dụng ức chế XO in vitro một cách rõ rệt ở cả

và liều cao Đặc biệt, cao chiết nước của quả cần tây liều thấp ức chế 41,9% hoạt tính xanthin oxidase trong huyết thanh và 11,3% trong gan chuột [33]

Trong một nghiên cứu khác của tác giả Nguyễn Thu Hằng và cộng sự, trên mô hình tăng acid uric huyết thanh cấp bằng kali oxonat trên chuột nhắt trắng, cao ethanol chiết từ quả cần tây ở mức liều 250 mg/kg, 500 mg/kg, 1000 mg/kg sử dụng liên tục trong 5 ngày có tác dụng giảm nồng độ acid uric so với lô chứng lần lượt là 59,3%, 52,6% và 43,8% Bên cạnh đó, cao ethanol chiết từ quả cần tây với liều 250 mg/kg và

500 mg/kg làm giảm hoạt độ xanthin oxidase (XO) gan chuột thí nghiệm tương ứng 12,1% và 10,5% [44]

1.1.2.2 Tác dụng chống viêm

Để đánh giá tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm cấp tính bằng natri urat, tác giả Shaopeng Li và cộng sự đã sử dụng cao chiết nước từ quả cần tây với các mức liều 50 mg/kg, 200 mg/kg và tinh dầu quả cần tây với các mức liều 0,039 ml/kg, 0,155 ml/kg Kết quả cho thấy, 2 loại mẫu thử trên đều thể hiện tác dụng giảm viêm khớp cấp tính so với lô chứng ở cả 2 mức liều Cụ thể, cao chiết nước từ quả cần tây liều cao làm giảm lần lượt 22,4% nồng độ IL-1β; 20,4% nồng độ IL-6; 17,2% nồng độ TNF-α và tăng 8,8% nồng độ IL-10 trong huyết thanh so với lô chứng Bên cạnh đó, tinh dầu quả

cần tây liều thấp cũng làm giảm 14,2% nồng độ TNF-α; 19,4% nồng độ IL-1β và tăng

hơn 14,3% nồng độ IL-10 trong huyết thanh so với lô chứng [33]

Trong một nghiên cứu khác của Mina Ramezani và cộng sự, cao chiết nước và

n-hexan từ quả cần tây ở các liều 100, 200, 300, 400 và 500 mg/kg được chứng minh có

tác dụng chống viêm mạnh trên mô hình gây phù tai chuột bằng xylen Trong đó, tác dụng chống viêm của cao chiết hexan từ quả cần tây liều 200 mg/kg tương đương với dexamethason liều 15 mg/kg với tỉ lệ ức chế lần lượt là 76,06% và 76,74% [51]

Trên mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan, cao ethanol chiết từ quả cần tây với các liều 250 và 500 mg/kg đều thể hiện tác dụng chống viêm tại thời điểm 1 giờ sau khi gây viêm Tỉ lệ ức chế phù tại các mức liều 250 và 500 mg/kg so với lô chứng lần lượt là 37,6% và 60,6% [2]

Hoạt tính chống viêm mạnh của quả cần tây có thể liên quan đến các hợp chất acid phenolic và flavonoid có trong dược liệu này Trong đó, apigenin và apiin, 2 flavonoid chính trong quả cần tây đã được chứng minh có tác dụng chống viêm cấp qua nhiều nghiên cứu Cụ thể, apigenin có khả năng kháng histamin và ức chế quá trình tạo

ra hydroperoxid; apiin có tác dụng ức chế sản xuất NO, hoạt động của

cyclooxygenase-2 (COX-cyclooxygenase-2) và từ đó ức chế quá trình viêm [51]

1.1.2.3 Tác dụng giảm đau

Theo Mina Ramezani và cộng sự, cao chiết nước và n-hexan từ quả cần tây tiêm

phúc mạc ở các mức liều 300, 400 và 500 mg/kg có tác dụng giảm đau trên mô hình gây đau bằng formalin được đánh giá thông qua số lần liếm và thời gian liếm của chuột trong

2 giai đoạn đau là đau thần kinh và đau do viêm sau khi tiêm formalin Hiệu quả giảm đau được so sánh với nhóm chứng sử dụng morphin Kết quả cho thấy, ở giai đoạn đau thần kinh, cao chiết nước không có tác dụng giảm đau, song cao chiết n-hexan liều 300,

400 và 500 mg/kg có tác dụng làm giảm đáng kể thời gian liếm với phần trăm giảm so với nhóm chứng tương ứng là 50,7; 62,7 và 55,2% Ở giai đoạn đau do viêm, cao chiết hexan liều 500 mg/kg thể hiện tác dụng giảm đau với thời gian liếm ở chuột giảm 7,5%

so với nhóm chứng [51]

Trong một nghiên cứu khác của Powanda và cộng sự, cao chiết ethanol từ quả cần tây thể hiện tác dụng giảm đau cấp và mạn tính trên chuột Trong mô hình gây đau cấp bằng carrageenan, cao chiết ethanol từ quả cần tây liều 500 mg/kg và cao chiết siêu tới hạn từ quả cần tây liều 70 mg/kg có tác dụng giảm đau tương đương với ibuprofen

liều 200 mg/kg Trên mô hình gây đau mạn tính, cao chiết quả cần tây liều 1500 mg/kg thể hiện tác dụng tương đương với naproxen liều 30 mg/kg và ibuprofen liều 100 mg/kg sau 10 ngày điều trị [50]

Tác dụng giảm đau của cao chiết từ quả cần tây có thể liên quan tới cơ chế tương tác với receptor NMDA và tác động vào quá trình sản sinh NO [50]

1.1.2.4 Một số tác dụng khác

Ngoài tác dụng hạ acid uric, chống viêm, giảm đau, quả cần tây còn thể hiện một

số tác dụng khác như: chống oxy hóa [22], [56], ức chế ngưng tập tiểu cầu [22], bảo vệ gan [56], chống hoại tử [22], lợi tiểu [22], kháng khuẩn [31], kháng nấm [31], cải thiện trí nhớ [22]

1.2 Tổng quan về dung môi eutectic

1.2.1 Định nghĩa

Dung môi eutectic (DES - Deep Eutectic Solvent) là hỗn hợp của 2 hay nhiều thành phần, trong đó bao gồm: một chất cho liên kết hydro (HBD - Hydrogen Bond

Donor) và một chất nhận liên kết hydro (HBA - Hydrogen Bond Acceptor) Hai chất

này có khả năng tương tác với nhau tạo thành hỗn hợp eutectic có điểm nóng chảy thấp hơn điểm nóng chảy của từng thành phần HBA và HBD, do đó hỗn hợp tồn tại ở trạng thái lỏng tại nhiệt độ phòng [27]

1.2.2 Thành phần

Hai thành phần chính cấu thành nên DES là chất nhận liên kết hydro - HBA và chất cho liên kết hydro - HBD Giữa các thành phần này không có phản ứng hóa học xảy ra và không tạo thành sản phẩm phụ [48]

Chất nhận liên kết hydro (HBA): Thường là các muối amoni bậc 4 Một trong

những HBA được sử dụng phổ biến nhất là cholin clorid nhờ tính an toàn, khả năng phân hủy sinh học và chi phí thấp [27] Ngoài ra, một số HBA khác như betain, prolin, acid lactic…cũng được ứng dụng rộng rãi trong các hệ dung môi eutectic [37]

Chất cho liên kết hydro (HBD): Thường là các hợp chất tự nhiên chứa O, N như

alcol, amin, acid carboxylic, ure…[34]

Trong từng trường hợp cụ thể, các hợp chất kể trên vừa có thể là chất cho liên kết hydro, vừa có thể là chất nhận liên kết hydro

Để làm giảm độ nhớt và tăng khả năng hòa tan, DES thường được pha loãng với nước [40] Một số nghiên cứu đã chỉ ra hầu hết các DES không ở trạng thái lỏng ở nhiệt

độ phòng, nhưng khi có mặt một lượng nhỏ nước (5 – 10%) thì hệ này tồn tại bền vững

ở trạng thái lỏng ở nhiệt độ phòng và thậm chí ở nhiệt độ thấp hơn [17] Tuy nhiên, lượng nước quá nhiều có thể ảnh hưởng đến các đặc tính của hệ như: độ nhớt, độ phân cực, độ tan, làm mất các liên kết hydro hiện có dẫn đến phá vỡ cấu trúc của hệ [17] Các nghiên cứu đã chứng minh khi hàm lượng nước trong hệ đạt 50% có thể gây ra sự đứt gãy các liên kết hydro và làm mất tương tác giữa các phân tử HBA và HBD, từ đó, phá hủy cấu trúc DES [49]

1.2.3 Phân loại

Hiện nay, DES có thể được phân loại dựa vào thành phần cấu tạo hoặc tác dụng sinh học của hệ dung môi

Cách 1: Dựa vào thành phần cấu tạo, DES được chia làm 4 loại như sau:

 Loại I: Được tạo thành từ muối amoni bậc 4 (điển hình là cholin clorid) kết hợp

với muối halogen của kim loại (thường sử dụng muối clorid của các kim loại như

Zn, Sn, Fe, Al, Ga…) [34], [62]

Ví dụ: Cholin clorid + ZnCl2, cholin clorid+ AlCl3…

 Loại II: Được tạo thành từ muối amoni bậc 4 (điển hình là cholin clorid) kết hợp

với muối halogen của kim loại ngậm nước (thường sử dụng muối clorid ngậm nước của các kim loại như Cr, Co, Cu, Ni, Fe…) [34], [62]

Ví dụ: Cholin clorid + MgCl2.6H2O, cholin clorid + CrCl3.6H2O…

 Loại III: Được tạo thành từ muối amoni bậc 4 (điển hình là cholin clorid) kết

hợp với các HBD như ure, glycerol, ethylen glycol, acid malonic và một số chất khác [34], [62]

Ví dụ: Cholin clorid + ure, cholin clorid + glycerol…

 Loại IV: Được tạo thành từ muối halogen kim loại (thường là muối clorid của

các kim loại lưỡng tính) kết hợp với các HBD như ure, glycerol, ethylen glycol, acid malonic và một số chất khác [34], [62]

Ví dụ: ZnCl2 + Ure…

DES loại I ít có ứng dụng trong thực tế do muối halogen của các kim loại khan

có nhiệt độ nóng chảy cao nên khó có thể sử dụng làm dung môi ở điều kiện thường Vì vậy, muối halogen của kim loại ngậm nước (loại II) thường được sử dụng phổ biến hơn

do muối hydrat có nhiệt độ nóng chảy thấp hơn muối khan, chi phí không cao cùng khả năng hút ẩm kém do trong thành phần đã sẵn có nước nên dễ dàng sử dụng trong quy

mô công nghiệp Trong khi đó, DES loại III lại có các ưu điểm như dễ chuẩn bị, không phản ứng với nước, có khả năng phân hủy sinh học, chi phí sản xuất thấp và khả năng hòa tan nhiều kim loại chuyển tiếp, bao gồm cả muối clorid kim loại và các oxid kim loại Mặt khác, so với DES loại I, II, IV có thể gây độc do trong thành phần có chứa muối kim loại, DES loại III tương đối an toàn, có khả năng tương thích sinh học cao hơn

và ít gây độc trên người Do đó, DES loại III là dung môi được nghiên cứu nhiều nhất hiện nay [55]

Cách 2: Dựa vào tác dụng sinh học, DES được chia thành 2 loại là hệ dung môi eutectic

trị liệu (THEDES - Therapeutic Deep Eutectic Solvents) và hệ dung môi eutectic tự nhiên (NADES - Natural Deep Eutectic Solvents)

 THEDES: Hệ dung môi eutectic trị liệu có hoạt chất là một trong những thành phần cấu tạo nên hệ [8], [13] Ví dụ: hệ THEDES được tạo thành khi kết hợp giữa tinh dầu bạc hà và ibuprofen với tỉ lệ 3:1 [8]

 NADES: Hệ dung môi eutectic tự nhiên có thành phần là các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên có thể tìm thấy trong tế bào hoặc các cơ thể sống và được chứng minh là dung môi thân thiện với môi trường [15] Hệ này được tạo thành từ việc phối hợp HBA điển hình là cholin clorid với các HBD như: glucose, fructose, acid malic, acid aconitic…[15]

1.2.4 Phương pháp điều chế

DES được tạo thành khi kết hợp HBA và HBD ở nhiệt độ và tỉ lệ mol xác định Một số phương pháp điều chế DES thường được sử dụng bao gồm: phương pháp gia nhiệt, phương pháp nghiền, phương pháp bay hơi, phương pháp đông khô và phương pháp hỗ trợ vi sóng

1.2.4.1 Phương pháp gia nhiệt

Nguyên tắc: Phối hợp các thành phần, đun nóng và khuấy liên tục cho đến khi tạo thành chất lỏng đồng nhất trong suốt Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất hiện nay [27], [49]

Phương pháp gia nhiệt có ưu điểm dễ thực hiện, thao tác đơn giản và chi phí thấp, song nhiệt độ cao có thể làm phân hủy hoặc bay hơi các thành phần trong hệ

1.2.4.2 Phương pháp nghiền

Nguyên tắc: Phối hợp các thành phần ở nhiệt độ phòng và nghiền đến khi tạo thành chất lỏng trong suốt [27]

Phương pháp nghiền thực hiện ở nhiệt độ phòng, do vậy khá an toàn cho các chất không bền với nhiệt Tuy nhiên, các thành phần trong hệ có thể bị phân hủy hoặc biến đổi cấu trúc dưới tác động của lực nghiền

1.2.4.3 Phương pháp bay hơi

Nguyên tắc: Các thành phần được hòa tan vào nước và cất quay dưới áp suất giảm ở 50°C Chất lỏng thu được được để trong bình hút ẩm với silicagel đến khối lượng không đổi [27], [49]

Phương pháp cất quay ở nhiệt độ thấp nên hạn chế sự phân hủy của các thành phần không bền với nhiệt, song lại có quá trình thực hiện khá phức tạp, giá thành cao và chỉ áp dụng được với hệ DES có các thành phần hòa tan được trong nước

1.2.4.4 Phương pháp đông khô

Nguyên tắc: Các thành phần riêng lẻ của DES được hòa tan trong nước tạo thành dung dịch Phối hợp các dung dịch này và tiến hành sấy đông khô để loại nước [27], [49]

Phương pháp này ít được sử dụng do không loại bỏ hoàn toàn nước khỏi hỗn hợp

và chỉ áp dụng được khi các thành phần của DES đều hòa tan được trong nước

Ngày nay, các DES có điểm nóng chảy thấp (<50oC) thường được ưu tiên sử dụng trong nhiều lĩnh vực [61]

1.2.5.2 Tỷ trọng

Tỷ trọng là một trong những tính chất quan trọng nhất của hệ DES, ảnh hưởng đến sự phân tách pha trong quá trình chiết xuất, đặc biệt là chiết phân bố lỏng - lỏng [23] Tỷ trọng của DES thường được xác định bằng máy đo khối lượng riêng Hầu hết các DES có tỷ trọng cao hơn nước và cao hơn so với HBD tinh khiết với mức dao động trong khoảng từ 1,04 g.cm-3 đến 1,63 g.cm-3 [23] Điều này có thể được giải thích do giữa các phân tử HBD có những lỗ trống, khi phối hợp 2 thành phần của hệ làm cho bán kính các lỗ trống này giảm, dẫn đến tỷ trọng của DES tăng nhẹ so với HBD [61]

Tỷ trọng của DES giảm tuyến tính khi nhiệt độ của hệ tăng [23], [61] Ngoài ra, thông số này còn bị ảnh hưởng nhiều bởi tỉ lệ các thành phần HBA/HBD trong hệ [61]

Vì vậy có thể thay đổi tỷ trọng của DES bằng cách thay đổi nhiệt độ và tỉ lệ các thành phần trong hệ

1.2.5.3 Độ nhớt

Hầu hết các DES đều có độ nhớt tương đối cao (>100 cps) và cao gấp 20 - 1000 lần so với nước ở nhiệt độ phòng [23] Độ nhớt cao được giải thích do sự hiện diện của mạng lưới liên kết hydro giữa các thành phần làm ngăn cản sự di chuyển của các phân

tử tự do trong hệ DES Ngoài ra kích thước ion lớn và thể tích các khoảng trống nhỏ kèm theo lực tương tác tĩnh điện và lực Van der Waals giữa các phân tử trong hệ cũng làm tăng độ nhớt của hệ [61]

Nhìn chung, độ nhớt của DES được quyết định bởi bản chất của các thành phần trong hệ (loại HBA và HBD, tỉ lệ HBA/HBD), nhiệt độ và hàm lượng nước [61] Nhiệt

độ tăng sẽ làm động năng của các phân tử trong hệ tăng Khi động năng tăng đến một mức nhất định và thắng lực liên kết giữa các phân tử sẽ làm cho độ nhớt của hệ giảm [37] Bên cạnh đó, hàm lượng nước tăng cũng có thể làm giảm độ nhớt của hệ [37]

1.2.5.4 Sức căng bề mặt

Sức căng bề mặt là một tính chất quan trọng của DES Do có sức căng bề mặt lớn nên khả năng chiết xuất của DES cao hơn so với các dung môi thông thường Sự tương tác giữa các thành phần HBA và HBD càng mạnh thì sức căng bề mặt của hệ càng cao [39] Sức căng bề mặt phụ thuộc chủ yếu vào nhiệt độ của hệ Sự phụ thuộc của sức căng bề mặt () với nhiệt độ được biểu hiện theo hàm tuyến tính sau [34]:

 = a + b.T

trong đó a, b là hằng số, T là nhiệt độ (K)

Khi nhiệt độ tăng, sức căng bề mặt giảm có thể gây ra sự gián đoạn và phá vỡ các liên kết hydro trong hệ DES Tuy nhiên, chiết xuất ở nhiệt độ cao có thể làm tăng độ hòa tan của các hợp chất [39] Do đó, cần điều chỉnh nhiệt độ để thu được sức căng bề mặt phù hợp nhằm thu được hiệu suất chiết xuất cao nhất mà không ảnh hưởng tới độ

ổn định của hệ

1.2.5.5 Khả năng phân hủy và tái sử dụng

Một trong những đặc tính hấp dẫn của DES là các thành phần cấu tạo của chúng đều có nguồn gốc tự nhiên, do đó có tính tương thích sinh học cao, có thể được tổng hợp

và chuyển hóa bởi các vi sinh vật So với dung môi hữu cơ và chất lỏng ion, khả năng phân hủy của DES giúp tránh các nguy cơ tiềm ẩn đối với môi trường Do đó, DES được coi là một dung môi “xanh”, thân thiện với môi trường [37]

Bên cạnh đó, DES cũng có thể dễ dàng thu hồi và tái sử dụng Cho đến nay có nhiều phương pháp đã được sử dụng để thu hồi DES như sử dụng CO2 siêu tới hạn, chiết ngược dòng, sử dụng nhựa trao đổi ion và sắc ký ngược dòng Nghiên cứu của Dai và cộng sự đã chứng minh việc pha loãng DES không ảnh hưởng đến các tính chất sắc ký của hệ, do đó có thể tiến hành đồng thời cả 3 quá trình: tách chất, phân tích và tái chế DES DES sau khi thu hồi có thể được bổ sung các thành phần của hệ và sử dụng lại [37]

1.2.5.6 Khả năng hòa tan

DES có khả năng chiết chọn lọc các hợp chất với hiệu suất chiết xuất cao Khả

năng hòa tan của hệ DES được giải thích theo 2 thuyết: thuyết lỗ trống (hole theory) và thuyết liên kết (binding theory) [37]

Theo thuyết lỗ trống, các phân tử HBA và HBD tương tác với nhau tạo thành một

mạng lưới (matrix) có cấu trúc giống như polyme và chất tan có thể khuếch tán vào các

lỗ trống trong mạng lưới phân tử này Khi tỉ lệ các thành phần trong DES thay đổi, kích thước và hình dạng các lỗ trống cũng thay đổi, do đó khả năng hòa tan của DES cũng thay đổi đáng kể Ví dụ khi thay đổi hàm lượng nước, kích thước lỗ trống có thể thay đổi từ cỡ micromet sang nanomet [37]

Theo thuyết liên kết, các chất tan sẽ liên kết với các thành phần trong hệ và trở thành một phần của DES Điều này có thể làm thay đổi tính chất hòa tan của cả hệ dung môi và chất tan [37]

1.2.5.7 Tính an toàn

Các nghiên cứu đã chỉ ra DES tương đối an toàn trên người [55] Độc tính của

DES thường giảm đi rất nhiều so với các thành phần riêng lẻ của hệ [58] Trên E coli,

với hàm lượng DES < 0,75 mM, vi khuẩn vẫn phát triển với tỷ lệ ức chế dưới 10% [58] Một nghiên cứu đánh giá độc tính của DES trên thực vật (tỏi) bằng cách đo chiều dài rễ

và quan sát sự bất thường của các tế bào đầu rễ cho thấy rễ tỏi vẫn phát triển bình thường dưới tác động của DES Như vậy, có thể kết luận dung môi eutectic khá an toàn với thực vật [58]

1.2.6 Ưu điểm và nhược điểm

1.2.6.1 Ưu điểm

DES ra đời như một dung môi thay thế hiệu quả cho chất lỏng ion (Ionic Liquid

- IL) [39] Hệ dung môi eutectic có các ưu điểm tương tự như IL, song chúng lại khắc phục được nhược điểm của dung môi này DES dễ điều chế, dễ phân hủy và tái sử dụng, khả năng chiết xuất chọn lọc các hợp chất với hiệu suất chiết lớn

Dung môi DES khá an toàn đối với người và thực vật Nghiên cứu của Hayyan

và cộng sự năm 2013 đã chứng minh hệ dung môi này không có độc tính trên vi khuẩn [34] Đặc biệt, DES loại III được chứng minh có tính an toàn cao và ít độc với người [55]

Bên cạnh đó, DES còn có khả năng tương tác đặc biệt với các hợp chất phenolic,

do đó làm tăng khả năng chiết xuất các flavonoid từ dược liệu mà cụ thể trong nghiên cứu này là hai hợp chất apigenin và luteolin trong quả cần tây [36]

DES còn được coi là dung môi “xanh” và thân thiện với môi trường do cấu tạo

từ các thành phần tự nhiên, không độc hại [34], có khả năng tự phân hủy và dễ tái chế DES có áp suất hơi bão hòa thấp hơn các dung môi khác, do đó hạn chế hiện tượng bay hơi vào môi trường [55]

DES cũng rất thích hợp để chiết xuất có hỗ trợ của vi sóng hay siêu âm do có hằng số điện môi cao hơn và hấp thụ nhiều năng lượng hơn dung môi hữu cơ thông thường, dẫn đến khả năng chiết xuất vượt trội, cho hiệu suất chiết cao và tiết kiệm năng lượng hơn trong quá trình chiết xuất [54]

Ngoài ra, DES còn có một số ưu điểm khác như: cấu trúc đơn giản, giá thành rẻ

và có khả năng cải tiến trong nhiều quy trình chiết xuất [34], [39]

1.2.6.2 Nhược điểm

Một trong những hạn chế chính của DES là độ nhớt cao ở nhiệt độ phòng Điều này có thể ngăn cản quá trình khuếch tán của các hợp chất từ tế bào ra ngoài môi trường, giảm khả năng hòa tan, do đó làm giảm hiệu suất chiết Bên cạnh đó, độ nhớt cao của hầu hết DES cũng gây ra một số thách thức cho quá trình định lượng bằng HPLC Dịch chiết có độ nhớt cao có thể gây sai lệch thể tích trong quá trình lấy mẫu của các thiết bị

tự động, đặc biệt khi cần lấy một lượng nhỏ thể tích Để khắc phục nhược điểm này, một

số nghiên cứu đã tiến hành trộn DES với dung môi hữu cơ để làm giảm độ nhớt Tuy nhiên điều này không phù hợp với xu hướng hóa học xanh, vì vậy cần hạn chế tối đa việc sử dụng dung môi hữu cơ kết hợp với DES Một giải pháp khác được đưa ra là thêm một lượng nhỏ nước (khoảng 10%), từ đó, giúp làm giảm nhanh độ nhớt của hệ [46] Bên cạnh đó, để làm giảm độ nhớt của DES còn có thể tiến hành bơm mẫu ở nhiệt độ cao hoặc sử dụng lực cơ học Tuy nhiên, các phương pháp giảm độ nhớt của DES vẫn cần phải được nghiên cứu thêm để nâng cao tính ứng dụng của hệ dung môi này [39]

Bên cạnh độ nhớt cao, khả năng bay hơi thấp cũng là một hạn chế của DES Áp suất hơi bão hòa thấp có thể ngăn cản quá trình phân tách các chất ra khỏi dung môi, dẫn đến khó thu hồi cao chiết [52] Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu nhằm tìm ra phương pháp thích hợp nhất để thu hồi các chất cần phân tích từ dịch chiết eutectic, tuy nhiên các phương pháp này vẫn còn nhiều hạn chế trong quá trình cô loại dung môi, tìm ra dung môi thích hợp để tách hoạt chất hay một số phương pháp còn để lẫn nhiều tạp, hiệu suất chưa cao, giá thành đắt, tốn kém chi phí Đây cũng là thách thức trong việc ứng

dụng hệ dung môi eutectic trong công nghiệp chiết xuất

Hơn nữa, hầu hết các DES đều có khả năng hút ẩm mạnh Hàm lượng nước cao

có thể phá vỡ liên kết giữa các thành phần làm giảm tính ổn định hóa học của hệ, do đó

có thể làm giảm hiệu suất chiết xuất

1.2.7 Ứng dụng

1.2.7.1 Ứng dụng trong chiết xuất

Các phương pháp chiết xuất hiện nay thường có thời gian chiết xuất kéo dài và tiêu thụ một lượng lớn dung môi hữu cơ, gây ra nhiều lo ngại về sức khỏe và môi trường DES - một dung môi xanh với khả năng chiết xuất chọn lọc đã được sử dụng để giải

quyết vấn đề này [34] Nhiều nghiên cứu đã chứng minh DES cho hiệu suất chiết xuất cao nhất trong các dung môi được khảo sát nhằm chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật [34] Các DES được sử dụng phổ biến nhất thường bao gồm acid lactic, cholin clorid và 1,2-propandiol [37]

Nhờ khả năng hình thành liên kết hydro, các hợp chất polyphenol đã trở thành mục tiêu chiết xuất của dung môi eutectic thông qua cơ chế liên kết hydro với các nhóm hydroxyl của polyphenol, thúc đẩy quá trình hòa tan của các hợp chất này Ngoài ra, do

có chứa nhân thơm và các liên kết đôi trong phân tử nên chúng còn có thể tương tác với nhau bởi liên kết π – π Tùy thuộc vào thành phần trọng hệ, độ phân cực của dung môi eutectic có thể được điều chỉnh để chiết xuất được các hợp chất polyphenol từ ít phân cực đến phân cực nhiều Vì vậy, DES được xem như một dung môi đầy hứa hẹn cho việc hòa tan chọn lọc các hợp chất polyphenol trong thực vật [23]

Mặc dù vậy, so với các dung môi hữu cơ, DES tương đối nhớt ở nhiệt độ phòng Điều này cản trở khả năng khuếch tán thụ động của chất tan qua thành tế bào và gây khó khăn trong quá trình chiết xuất

Bên cạnh đó, DES cũng rất khó bay hơi Do đó, cần nghiên cứu các phương pháp

để dễ dàng thu hồi và tái sử dụng DES [37]

1.2.7.2 Ứng dụng trong sắc ký

Nhờ khả năng chiết xuất chọn lọc và cho hiệu suất chiết xuất cao đối với hợp chất

tự nhiên, DES có thể được sử dụng trong sắc ký để làm pha động hoặc tách các thành phần có hoạt tính sinh học trong giai đoạn xử lý mẫu [37] Việc sử dụng DES đã được chứng minh giúp cải thiện đáng kể độ phân giải của các pic sắc ký [34]

Ngoài ra, DES còn được sử dụng trong việc chuẩn bị chất hấp phụ pha tĩnh Nghiên cứu của tác giả Li và cộng sự đã sử dụng 5 loại silica trung tính dựa trên DES làm một chất hấp phụ và hỗn hợp ba dextran (trọng lượng phân tử lần lượt là 5, 50, và

670 kD) được lựa chọn để đánh giá các thuộc tính của cột Trong nghiên cứu này, độ phân giải R là yếu tố chính để đánh giá hiệu quả sắc ký, thể hiện sự phân tách giữa các hợp chất Kết quả cho thấy, hệ cholin - 1,2-butadiol và hệ cholin - acid acetic cho độ phân giải tốt nhất đối với các dextran được khảo sát, do đó chúng có khả năng ứng dụng cao để cải thiện kết quả sắc ký [34]

1.2.7.3 Một số ứng dụng khác

Ngoài ứng dụng trong chiết xuất và sắc ký, DES còn được ứng dụng trong một

- Trong nhiên liệu: DES có khả năng khử nitơ và lưu huỳnh - những chất ức chế quá trình hydrodesulfur hóa trong các loại nhiên liệu [34]

1.2.8 Một số nghiên cứu ứng dụng hệ dung môi eutectic trong lĩnh vực chiết xuất

1.2.8.1 Nghiên cứu chiết xuất flavonoid từ Hoàng cầm (Scutellaria baicalensis Georgi.)

Hoàng cầm là một dược liệu được sử dụng phổ biến với tác dụng điều trị sốt [45], tiêu chảy [45], viêm phổi [45], chống viêm [29], chống ung thư [60] Trong đó, flavonoid được cho là thành phần chính quyết định các tác dụng sinh học của Hoàng cầm [45] Trong nghiên cứu của tác giả Wim Wouter Oomen và cộng sự, để lựa chọn hệ dung môi

có khả năng chiết xuất flavonoid từ Hoàng cầm tốt nhất, 4 hệ DES gồm acid β-alanin -

acid citric (N1), glucose - acid citric (N2), xylitol - acid citric (N3) và prolin – acid citric (N4) được sử dụng và so sánh với dung môi đối chứng là nước, methanol 80% và ethanol 70% [46] Kết quả cho thấy, tổng lượng flavonoid thu được khi sử dụng DES cao hơn nhiều so với nước, methanol và ethanol [46] Cụ thể, lượng baicalein, scutellarein, wogonin và oroxylin A chiết được nhiều hơn 3 - 5 lần so với chiết bằng methanol 80% [46] Đặc biệt, hiệu suất chiết xuất cao nhất được quan sát thấy ở mẫu N1 và N4 [46] Do

đó, DES được coi là một dung môi xanh tiềm năng thay thế cho các dung môi hữu cơ thông thường trong chiết xuất flavonoid [46]

1.2.8.2 Nghiên cứu chiết xuất flavonoid từ Thanh tiền liễu (Cyclocarya paliurus (Batal.)

Iljinskaja)

Cyclocarya paliurus (Batal.) Iljinskaja là một dược liệu được sử dụng rộng rãi ở

Trung Quốc Nhóm nghiên cứu của tác giả X Shang và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu

ứng dụng DES để chiết xuất 5 flavonoid từ lá Cyclocarya paliurus là

7-O-α-L-rhamnosid, kaempferol, quercetin, quercetin-3-O-β-D-glucuronid, và 3-O-β-D–glucuronid Kết quả cho thấy, các DES khác nhau cho hiệu suất chiết xuất khác nhau Trong đó, DES từ amin và alcol cho hiệu suất chiết cao hơn DES từ đường

kaempferol-và acid carboxylic Các hệ cho hiệu suất chiết xuất cao nhất là cholin clorid : ure (tỉ lệ 1:1) và cholin clorid : 1,4-butanediol (tỉ lệ 1:5) Do đó, 2 hệ này được lựa chọn làm dung

môi chiết xuất flavonoid từ lá Cyclocarya paliurus [54]

1.2.8.3 Nghiên cứu chiết xuất acid phenolic từ lá Bạch quả (Ginkgo biloba L.)

Bạch quả là một dược liệu được sử dụng rộng rãi với các hợp chất chính là flavonoid, terpen lacton, acid ginkgolic Đặc biệt, các acid phenolic có trong lá Bạch

quả như: acid shikimic, acid 6-hydroxykynurenic, acid protocatechuic, acid

p-hydroxybenzoic và acid gallic cũng có liên quan đến một số hoạt tính sinh học của dược liệu này Trong nghiên cứu của Jun Cao và cộng sự, DES được ứng dụng để chiết xuất đồng thời các acid trên [46]

Trong nghiên cứu này, DES được tạo thành khi kết hợp thành phần 1 là một trong

số các hợp chất: 1,3-butanediol, propylen glycol xylitol và betain với thành phần 2 là các acid như acid citric, acid malonic, acid glycolic và acid levulinic… Kết quả cho thấy, đối với thành phần 1, DES chứa xylitol cho hiệu quả chiết xuất cao nhất, tiếp theo

là DES từ propylen glycol và 1,3-butanediol, DES chứa betain cho hiệu suất chiết xuất thấp nhất Đối với thành phần 2, tùy từng hệ DES sẽ cho hiệu suất cao với từng acid khác nhau Ví dụ acid glycolic, acid malic, acid citric là những thành phần phù hợp để chiết xuất acid protocatechuic hay acid levulinic và acid citric, propylen glycol, glycerol

và sorbitol cho khả năng chiết xuất hiệu quả đối với acid p-hydroxybenzoic [12]

Duarte và cộng sự đã sử dụng các DES khác nhau để chiết xuất các hợp chất phenolic từ hạt cà phê xanh và so sánh với aceton Kết quả cho thấy DES rất hiệu quả trong việc chiết xuất các hợp chất phenolic từ hạt cà phê xanh [54]

Tất cả những nghiên cứu này đã cho thấy DES có thể được sử dụng làm dung môi thích hợp để chiết xuất chọn lọc và hiệu quả các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật [54]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, thiết bị

Hóa chất dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích bao gồm:

- Các dung môi/hóa chất hữu cơ: Ethanol, methanol, ethyl acetat, lactose, glucose, propylen glycol, acid citric, acid acetic, glycerin, saccharose, cholin clorid, betain, acetonitril (HPLC)

- Hóa chất vô cơ: Acid phosphoric, than hoạt tính, nước cất 2 lần

- Chất chuẩn: Apigenin chuẩn (độ tinh khiết 98,03%), luteolin chuẩn (độ tinh khiết 99,55%) được cung cấp bởi công ty Biopurify Phytochemicals Ltd

2.1.2.2 Dụng cụ

- Cân phân tích Presica (Thụy Sĩ), độ chính xác 0,1 mg

- Cân kỹ thuật Sartorius (Đức), độ chính xác 0,01g

- Máy siêu âm Sonic vibra cell (Mỹ)

- Máy ly tâm Universad 320 (Đức)

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu CDD-10AVP; detector DAD; cột sắc ký Shim-pack GIS C18, kích thước 250  4,6 mm, đường kính hạt 5 µm

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Máy đo hàm ẩm Presica XM60 (Thụy Sĩ)

- Thiết bị cách thủy Memmert (Đức)

- Máy lọc hút chân không (Trung Quốc)

- Các dụng cụ lấy mẫu: Pipet pasteur, pipet chính xác 0,5 ml, 1 ml, 2 ml, 5 ml, bình định mức 10 ml, quả bóp cao su, ống nghiệm

2.1.2.3 Phần mềm

Phần mềm: Design Expert 11

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nội dung 1: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết quả cần tây

Xây dựng phương pháp định lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết quả cần tây bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Phương pháp định lượng được thẩm định đầy đủ về độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, sự phù hợp của hệ thống, độ lặp lại và độ đúng

2.2.2 Nội dung 2: Khảo sát và lựa chọn hệ dung môi eutectic

Khảo sát khả năng tạo thành hệ dung môi eutectic từ các cặp chất HBA và HBD tương ứng theo tỉ lệ mol và điều kiện xác định

Tiến hành chiết xuất quả cần tây bằng các hệ dung môi eutectic đã được khảo sát

ở trên thu được các mẫu dịch chiết So sánh hàm lượng của hai hợp chất trong các mẫu dịch chiết, từ đó lựa chọn ra hệ dung môi có khả năng chiết xuất tốt nhất

2.2.3 Nội dung 3: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao đặc giàu apigenin và luteolin từ quả cần tây

Lựa chọn khoảng khảo sát các yếu tố đầu vào của quá trình chiết xuất bằng phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT) Các yếu tố đầu vào gồm: Thời gian chiết xuất (phút), nhiệt độ chiết xuất (oC), hàm lượng nước trong dung môi (%) Thông số đánh giá: Hàm lượng apigenin và hàm lượng luteolin trong dịch chiết quả cần tây

2.2.4 Nội dung 4: Khảo sát và lựa chọn các điều kiện tối ưu cho quá trình chiết xuất cao đặc giàu apigenin và luteolin từ quả cần tây

Khảo sát và lựa chọn các điều kiện tối ưu cho quá trình chiết xuất với mục tiêu hàm lượng apigenin và hàm lượng luteolin trong dịch chiết lớn nhất

2.2.5 Nội dung 5: Khảo sát và lựa chọn phương pháp điều chế cao đặc giàu apigenin

và luteolin từ dịch chiết quả cần tây trong DES

Khảo sát các phương pháp điều chế cao đặc từ dịch chiết quả cần tây trong DES

Từ đó, so sánh và lựa chọn phương pháp thích hợp nhất để xây dựng quy trình chiết xuất hoàn chỉnh Thông số đánh giá: Tỷ lệ % khối lượng cao thu được, hàm lượng apigenin trong cao đặc, hàm lượng luteolin trong cao đặc

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Quy trình chiết xuất dự kiến

Quả cần tây được xay nhỏ và rây qua rây có kích thước mắt rây 0,25 mm, lấy phần bột lọt qua rây để chiết xuất

Cân chính xác khoảng 0,2000 g dược liệu cho vào ống nghiệm Thêm chính xác

4 ml dung môi Tiến hành chiết xuất trong 20 phút rồi ly tâm dịch chiết với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút Gạn thu lấy phần dịch Dịch chiết sau khi gạn được tiến hành điều chế cao đặc bằng phương pháp thích hợp

Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất cao cần tây được trình bày như trên hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất cao cần tây

2.3.2 Phương pháp định lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết quả cần tây

Xác định hàm lượng apigenin và hàm lượng luteolin trong dịch chiết quả cần tây bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [25]

Phương pháp định lượng được thẩm định về độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính và đường chuẩn, sự phù hợp của hệ thống, độ lặp lại và độ đúng dựa trên các điều kiện sắc

ký đã được lựa chọn ở trên [9]

2.3.3 Phương pháp khảo sát và lựa chọn hệ dung môi eutectic

Chuẩn bị 34 hệ dung môi bằng cách phối hợp các cặp chất HBA và HBD trong điều kiện xác định Loại bỏ các hệ không thể tạo thành dung môi đồng nhất ở điều kiện thường, những hệ còn lại được lựa chọn để tiến hành khảo sát khả năng chiết xuất apigenin và luteolin từ quả cần tây

Tiến hành chiết xuất theo các bước mô tả ở mục 2.3.1 để thu lấy dịch chiết Các dung môi sử dụng là các hệ đồng nhất được lựa chọn ở bước khảo sát trên, các dung môi đối chiếu là nước, methanol và ethanol 70% Xác định hàm lượng apigenin và hàm lượng luteolin trong các mẫu dịch chiết, so sánh khả năng chiết xuất của các hệ DES, nước, methanol và ethanol 70% Trên cơ sở đó lựa chọn dung môi chiết xuất trong các bước khảo sát tiếp theo

2.3.4 Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất

2.3.4.1 Lựa chọn yếu tố khảo sát và thông số đánh giá

Yếu tố khảo sát:

- Thời gian chiết xuất: 5 phút, 10 phút, 20 phút, 40 phút, 60 phút

- Nhiệt độ chiết xuất: 45°C, 60°C, 75°C, 90°C

- Hàm lượng nước trong hệ dung môi: 10%, 20%, 30%, 40% và 50% (kl/kl)

Thông số đánh giá:

Hàm lượng apigenin (hoặc hàm lượng luteolin) trong dịch chiết được xác định

bằng HPLC và được tính theo công thức:

X (mg/g) = (𝑆−𝑏).𝑉.100

𝑎.𝑚1.(100−𝐴%).1000Trong đó: X: hàm lượng apigenin hoặc hàm lượng luteolin trong dịch chiết (mg/g)

S: diện tích pic (µAU.s)

b: hệ số chặn của đường chuẩn V: thể tích dịch chiết (ml) a: hệ số góc đường chuẩn

m1: khối lượng dược liệu (g) A%: độ ẩm dược liệu, được xác định bằng phương pháp mất khối lượng

do làm khô [1], (A% = 10,45%)

2.3.4.2 Phương pháp khảo sát

Phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT)

Các yếu tố thời gian chiết xuất, nhiệt độ chiết xuất, hàm lượng nước trong hệ dung môi lần lượt được khảo sát bằng cách thay đổi các mức giá trị khác nhau của một yếu tố Các yếu tố còn lại sẽ được giữ cố định, không thay đổi giữa các thí nghiệm Từ kết quả các khảo sát, lựa chọn điều kiện cho hàm lượng apigenin và hàm lượng luteolin lớn nhất Các điều kiện này được cố định để thực hiện các bước khảo sát tiếp theo

2.3.5 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và lựa chọn các điều kiện tối ưu cho quá trình chiết xuất

Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)

Lựa chọn khoảng khảo sát các biến đầu vào

Ba biến đầu vào được lựa chọn là: Thời gian chiết xuất (X1), nhiệt độ chiết xuất (X2), hàm lượng nước trong hệ dung môi (X3) với khoảng khảo sát như sau:

- Thời gian chiết xuất (X1): 10 phút - 40 phút

- Nhiệt độ chiết xuất (X2): 45°C - 75°C

- Hàm lượng nước trong hệ dung môi (X3): 20% - 40% (kl/kl)

Các biến đầu vào được mã hóa thành các giá trị nằm trong khoảng [-1;1] và được tính toán từ giá trị thực tế theo công thức:

- Thời gian chiết xuất: X1 = Giá trị thực - 25

Với các điều kiện biến đầu vào được khảo sát, các biến đầu ra được lựa chọn là:

Hàm lượng apigenin (Y1) và hàm lượng luteolin (Y2) trong dịch chiết quả cần tây

Thiết kế thí nghiệm

Các thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên theo mô hình phức hợp trung tâm kiểu hướng mặt, sử dụng phần mềm Design Expert 11

Tối ưu hóa quá trình chiết xuất

Quá trình chiết xuất được tối ưu hóa thông qua các bước:

với các biến đầu vào (X1, X2, X3) bằng phương pháp hồi quy tuyến tính đa biến (MLR),

sử dụng phần mềm Design Expert 11 Phương trình được thiết lập với các biến đầu vào mang giá trị thực và giá trị đã được mã hóa

Dựa trên các mô hình đã xây dựng, tiến hành đánh giá độ chính xác, độ tuyến tính, khả năng dự đoán và sự phù hợp của mô hình với số liệu thực nghiệm thông qua

giá trị p-value, hệ số xác định R 2 , hệ số xác định hiệu chỉnh R 2 hiệu chỉnh và R 2 dự đoán

Bước 2: Từ kết quả xây dựng mô hình, lựa chọn điều kiện tối ưu của các biến đầu

vào để đạt được mục tiêu thu được hàm lượng apigenin và hàm lượng luteolin tối đa Tại điều kiện tối ưu vừa được lựa chọn, tiến hành kiểm định mô hình bằng thực nghiệm

3 lần nhằm đánh giá độ lặp lại, độ chính xác và sự phù hợp giữa mô hình so với giá trị thực nghiệm

2.3.6 Lựa chọn phương pháp điều chế cao đặc quả cần tây từ dịch chiết DES

2.3.6.1 Phương pháp tiến hành

Sau khi thu được dịch chiết quả cần tây bằng hệ dung môi eutectic và các điều kiện được tối ưu ở trên, cao đặc quả cần tây được điều chế bằng một trong các phương pháp sau:

Phương pháp 1: Sử dụng than hoạt

Thêm vào dịch chiết một lượng than hoạt bằng 10% tổng khối lượng dịch chiết Ngâm khoảng 15 phút kết hợp khuấy trộn để hoạt chất trong dịch chiết được hấp phụ hoàn toàn lên bề mặt than Sau đó, tiến hành lọc lấy than hoạt bằng thiết bị lọc chân không Lượng than hoạt sau khi lọc được tiến hành giải hấp phụ bằng ethanol 96% Lọc lấy dịch và cô loại dung môi đến khi thu được cao đặc

Phương pháp 2: Sử dụng phản dung môi

Nguyên tắc của phương pháp là thêm một lượng lớn nước để phá vỡ liên kết giữa HBA và HBD, làm mất đặc tính của hệ DES [52] Hai hợp chất apigenin và luteolin không tan được trong nước nên sẽ tủa lại Trong nghiên cứu này, dịch chiết được thêm nước theo tỷ lệ 1:20, để kết tinh trong khoảng 1 giờ ở 0oC [42] Tiến hành ly tâm 10 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút, lọc thu lấy tủa Tủa được sấy đến khi đạt thể chất thích hợp

Song song với việc thêm nước, dịch chiết có thể được cô loại dung môi trước, sau đó thêm nước để kết tủa hợp chất, rồi tiến hành ly tâm lấy tủa, lọc tủa và sấy đến khi đạt thể chất thích hợp

A3: hàm lượng luteolin trong cao đặc (mg/g)

S: diện tích pic (µAU.s) b: hệ số chặn của đường chuẩn V: thể tích dịch chiết (ml) a: hệ số góc đường chuẩn

m2: khối lượng cao (g)