Bước đầu tạo cây tiêu Piper nigrum In vitro kháng nấm Phytophthoro sp.

Bước đầu tạo cây tiêu Piper nigrum In vitro kháng nấm Phytophthoro sp.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  ĐINH VŨ THẮNG BƢỚC ĐẦU TẠO CÂY TIÊU (Piper nigrum) IN VITRO KHÁNG NẤM Phytophthora sp. LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  BƢỚC ĐẦU TẠO CÂY TIÊU (Piper nigrum) IN VITRO KHÁNG NẤM Phytophthora sp. Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS. NGUYỄN THỊ KIM LINH ĐINH VŨ THẮNG TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN NIÊN KHÓA: 2002-2006 Thành phố Hồ Chí Minh 2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY,HCHC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY  INITIAL RESEACH CREATE PEPPER (Piper nigrum) IN VITRO RESISTANTTO Phytophthora sp. GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student MSc. NGUYEN THI KIM LINH DINH VU THANG Dr. LE ĐINH ĐON TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 i LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. - Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua. - Thầy Lê Đình Đôn và cô Nguyễn Thị Kim Linh đã tận tình hƣớng dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - Các anh chị phụ trách phòng 118 và 105 Khu Phƣợng Vỹ thuộc Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật - Đại học Nông Lâm TP. HCM. - Thầy Trần Ngọc Hùng cùng các chị thuộc Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Đại học Nông Lâm TP. HCM. - Tập thể lớp CNSH28, hai bạn Nhã Trầm và Thanh Huyền lớp CNSH29 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và làm đề tài. Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. TP. Hồ Chí Minh tháng 08 năm 2006 Đinh Vũ Thắng ii TÓM TẮT ĐINH VŨ THẮNG, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006. “BƢỚC ĐẦU TẠO CÂY TIÊU (Piper nigrum) IN VITRO KHÁNG NẤM Phytophthora sp.” Giáo viên hƣớng dẫn: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN ThS. NGUYỄN THỊ KIM LINH Đề tài “Bƣớc đầu tạo cây tiêu (Piper nigrum) in vitro kháng nấm Phytophthora sp.” đƣợc tiến hành giai đọan đầu là giai đoạn tạo ra cây tiêu trong phòng thí nghiệm tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học và Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh từ tháng 2 đến tháng 6 năm 2006. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của dịch chiết nấm Phytophthora đến khả năng hình thành chồi từ mô sẹo tiêu  Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4D và 3mg/L BA.  Nuôi cấy tạo dịch nấm Phytophthora  Thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu Thực hiện chủng dịch nấm Phytophthora vào môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo tiêu với nhiều nồng độ dịch nấm khác nhau. (bảng bố trí thí nghiệm). Thí nghiệm 2: Nhuộm mẩu mô sẹo Nhuộm mẫu bằng phẩm nhuộm hai màu là dung dịch gồm hai thứ phẩm nhuộm: - Phẩm đỏ Carmin sẽ nhuộm màu hồng lạt hay tím lạt nếu màng tế bào bằng chất cellulose pectic. - Phẩm xanh lục vert d’iod sẽ nhuộm màu xanh lục nếu màng tế bào bằng chất gỗ (ligin) hay bần (suberin). iii Bố trí thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu Phƣơng pháp vô trùng Nghiệm thức Nồng độ dịch nấm (%) Số chai Số mẫu/chai Tổng số mẫu DC 0 15 2 30 Hấp khử trùng CC 5 15 2 30 CB 10 15 2 30 CA 20 15 2 30 Lọc vô trùng KC 5 15 2 30 KB 10 15 2 30 KA 20 15 2 30 Ghi chú: DC: đối chứng có nồng độ dịch nấm là 0%, CC: nồng độ dịch nấm 5% có hấp khử trùng, CB: nồng độ dịch nấm 10% có hấp khử trùng, CA: nồng độ dịch nấm 20% có hấp khử trùng, KC: nồng độ dịch nấm 5% lọc vô trùng, KB: nồng độ dịch nấm 10% lọc vô trùng, KA: nồng độ dịch nấm 20% lọc vô trùng. iv MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT . ii MỤC LỤC . iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT . vii DANH SÁCH CÁC BẢNG viii DANH SÁCH CÁC HÌNH . ix PHẦN 1. GIỚI THIỆU . 1 1.1 Đặt vấn đề . 1 1.2 Mục đích . 2 1.3 Yêu cầu . 2 1.4 Giới hạn đề tài . 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3 2.1 Nguồn gốc và lịch sử phát triển cây tiêu 3 2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hạt tiêu trên thế giới và Việt Nam . 3 2.2.1 Thế giới 3 2.2.2 Việt Nam 4 2.2.2.1 Tình hình sản xuất . 4 2.2.2.2 Tình hình tiêu thụ 7 2.3 Tình hình bệnh trên cây tiêu . 8 2.3.1 Bệnh chết nhanh dây tiêu do nấm Phytophothra gây ra 8 2.3.2 Điều kiện phát sinh bệnh, phát triển bệnh 9 2.4 Giới thiệu về giống Phytophthora 9 2.5 Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật 10 2.6 Sự hình thành và phát triển của mô sẹo 15 2.6.1 Sự hình thành mô sẹo . 15 2.6.2 Sự hình thành chồi từ mô sẹo . 17 2.7 Các nhóm chất kích thích ảnh hƣởng lên quá trình tạo mô sẹo . 17 v 2.7.1 Auxin 17 2.7.1.1 Tính chất sinh lý của Auxin . 18 2.7.1.2 Auxin trong cây trồng 18 2.7.1.3 Các chất auxin tổng hợp 19 2.7.2 Cytokinine 19 2.7.2.1 Tính chất sinh lý của Cytokinine . 20 2.7.2.2 Cytokinine trong cây trồng 20 2.8 Một số nghiên cứu tạo cây kháng bệnh bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro 20 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 22 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22 3.2 Thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm 22 3.2.1 Phòng chuẩn bị môi trƣờng . 22 3.2.2 Phòng cấy cây 22 3.2.3 Phòng cấy nấm . 22 3.2.4 Phòng nuôi cây . 23 3.2.5 Môi trƣờng cơ bản dùng trong thí nghiệm . 23 3.3. Vật liệu nuôi cấy 23 3.4. Phƣơng pháp thí nghiệm 24 3.4.1 Thí nghiệm : Ảnh hƣởng của dịch chiết nấm Phytophthora đến khả năng hình thành chồi từ mô sẹo tiêu . 24 3.4.1.1 Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro 24 3.4.1.2 Nuôi cấy tạo dịch nấm Phytophthora 24 3.4.2.3 Thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu . 25 3.4.4 Nhuộm mẫu mô sẹo và xem kết quả dƣới kính hiển vi . 27 3.5 Phân tích thống kê 27 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Thí nghiệm : Ảnh hƣởng của dịch chiết nấm Phytophthora đến khả nằng hình thành chồi từ mô sẹo tiêu 28 4.1.1 Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro . 28 vi 4.1.2 Thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu . 28 4.3 Nhuộm mẫu mô sẹo tiêu sau 10 tuần nuôi cấy . 34 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 5.1 Kết luận . 37 5.2 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 MỤC LỤC 1 . 39 MỤC LỤC 2 . 40 vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT HSTTMS: Hệ số tăng trƣởng mô sẹo BA: Benzyladenine 2,4-D: 2,4 – Dichlorophenoxyacetic Acid MS: Murashige & Skoog ctv: Cộng tác viên [...]... ngƣời ta đặt tên là kinétine, do ADN biến chất Cytokinine là các chất adenine đƣợc thay thế, chất này đƣợc ngƣời ta biết qua 2 nhóm nội sinh là:  Zeatine  Isopentényladénine (IPA), Cytokinine tự nhiên và các chất tổng hợp Có hai 20 loại đƣợc sử dụng nhiều nhất là: Kinetine ( 6 furfuryl-aminopurine) Benzyladenine (BAP) (6-benzyl- aminopurine) 2.7.2.1 Tính chất sinh lý của Cytokinine - Tác động hiệu... cứu về biện pháp sử dụng nấm đối kháng vẫn chƣa thực sự có hiệu quả Vì vậy cần phải có những dòng tiêu có khả năng chống chịu với nấm Phytophthora để làm giảm thiệt hại do loại nấm này gây ra Trƣớc những yêu cầu cấp thiết đó chúng tôi quyết định thực hiện đề tài Tạo cây tiêu (Piper nigrum) in vitro kháng nấm Phytophthora sp. để tạo ra những dòng tiêu có khả năng chống chịu với nấm Phytophthora nhằm... dừng lại ở giai đoạn tạo ra cây tiêu in vitro trong phòng thí nghiệm 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nguồn gốc và lịch sử phát triển cây tiêu Cây tiêu (Piper nigrum) thuộc họ Piperaceae Có nguồn gốc từ tây nam Ấn Độ nằm ở vùng Ghats và Assam, mọc hoang trong rừng, đƣợc ngƣời Ấn Độ phát hiện, sử dụng đầu tiên và cho rằng việc phát hiện này là rất quý giá Đến đầu thế kỷ thứ XIII cây tiêu mới đƣợc trồng... của cây ngô (là zeatine); chất thứ hai là IPA thấy ở trong cây bị nhiễm vi khuẩn Corynebacterium fascines Chúng định vị ở lá non trong chồi và ở các đầu của rễ cây 2.8 Một số nghiên cứu tạo cây kháng bệnh bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro Dựa trên kỹ thuật chọn dòng đột biến in vitro, Steiner, đã chọn đƣợc dòng mía chống chịu bệnh mắt én (eyes spot), bệnh này do Helmintosporium sacchari, một loại nấm. .. đã đƣợc tái sinh thành công ở ngô, ở khoai tây ở lúa mì Behnke (1980) ghi nhận rằng lá cây khoai tây tái sinh từ mô sẹo đƣợc chọn lọc tính kháng với dịch vô trùng (FP) Phytophthora infestans thể hiện tính kháng với FP này tốt hơn so với đối chứng Tuy nhiên, không có sự liên hệ hoàn toàn về mặt tính kháng FP đƣợc quan sát ở cây tái sinh và cây đối chứng đƣợc xử lý bào tử nấm Cây kháng bệnh đầu tiên đƣợc... chiết nấm Phytophthora đến khả năng hình thành chồi từ mô sẹo tiêu 3.4.1.1 Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro  Tiến hành thí nghiệm Sử dụng môi trƣờng nuôi cấy tạo mô sẹo từ lá cây tiêu là môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D và 3mg/L BA Quá trình hình thành mô sẹo sẽ xày ra trong bóng tối, và mô sẹo sẽ hình thành từ những vết vết thƣơng trong quá trình cắt mẫu lá Sử dụng cây tiêu nuôi cấy in vitro, ... thiệt hại của loài nấm này gây ra 2 1.2 Mục đích - Tạo cây tiêu có khả năng chống chịu nấm Phytophthora 1.3 Yêu cầu - Thực hiện chủng dịch nấm Phytophthora vô trùng với nhiều nồng độ khác nhau trên mô sẹo tiêu - Bƣớc đầu tạo ra nhiều cá thể sau đó thực hiện việc chọn lọc các cá thể có tính kháng cao - Thực hiện nhuộm mẫu mô sẹo tiêu, xem hình thái để bƣớc đầu đánh giá ảnh hƣởng của dịch nấm đối với sự... hƣởng của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trƣờng nuôi cấy đối với việc hình thành các cơ quan của mô sẹo thuốc lá Khi giảm thấp tỷ lệ kinetin/auxin, mô sẹo có khuynh hƣớng phát triển rễ, ngƣợc lại nếu tỷ lệ kinetin/auxin tăng thì dẫn đến hiện tƣợng tạo chồi ở mô sẹo Hiện tƣợng này đƣợc xác nhận trên nhiều cây khác nhau và đóng góp rất lớn vào điều khiển sinh trƣởng, phát triển, phát sinh cơ quan của mô... tái sinh cây từ những dòng tế bào cho tính kháng ổn định Cây kháng bệnh vàng lá đƣợc tái sinh sau khi xử lý tế bào đơn bội thuốc lá với các toxin của vi khuẩn Sau đó những kết quả tƣơng tự đƣợc ghi nhận khi sử dụng mô nhị bội nuôi cấy, với hệ thống nuôi cấy tế bào hay protoplast và mô sẹo, có hay không có chất xử lý đột biến, gần đây cây kháng bệnh đã đƣợc tái sinh ở ngô và mía qua chọn lọc in vitro. .. Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/L CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O Vitamins 0,025 mg/L 0,025 mg/L Inositol 100 mg/L Nicotinic 0,5 mg/L Pyridoxin HCl 0,5 mg/L FeSO4.7H2O 27,8 mg/L Thiamin HCl 0,1 mg/L Na2 EDTA.2H2O 37,3 mg/L Glyxin Fe EDTA 2 mg/L 3 Vật liệu nuôi cấy Đối tƣợng đƣợc dùng để thí nghiệm là cây tiêu Vĩnh Linh in vitro có sẵn trong phòng thí nghiệm của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Đại học Nông Lâm TP HCM 24 3.4 Phƣơng . THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  BƢỚC ĐẦU TẠO CÂY TIÊU (Piper nigrum) IN VITRO KHÁNG NẤM Phytophthora sp. Giáo viên. Đinh Vũ Thắng ii TÓM TẮT ĐINH VŨ THẮNG, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006. “BƢỚC ĐẦU TẠO CÂY TIÊU (Piper nigrum) IN VITRO KHÁNG