Môi trƣờng dùng trong thí nghiệm là MS (Murashige & Skoog), gồm các thành phần sau:
Nguyên tố đa lượng
NH4NO3 1650 mg/L KNO3 1900 mg/L MgSO4.7H2O 370 mg/L KH2PO4 170 mg/L CaCl2.2H2O 440 mg/L Vitamins Inositol 100 mg/L Nicotinic 0,5 mg/L Pyridoxin HCl 0,5 mg/L Thiamin HCl 0,1 mg/L Glyxin 2 mg/L Nguyên tố vi lượng H3BO3 6,2 mg/L MnSO4.4H2O 22,5 mg/L ZnSO4.7H2O 8,6 mg/L KI0,83 mg/L Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/L CuSO4.5H2O 0,025 mg/L CoCl2.6H2O 0,025 mg/L Fe EDTA FeSO4.7H2O 27,8 mg/L Na2 EDTA.2H2O 37,3 mg/L
.3. Vật liệu nuôi cấy
Đối tƣợng đƣợc dùng để thí nghiệm là cây tiêu Vĩnh Linh in vitro có sẵn trong phòng thí nghiệm của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Đại học Nông Lâm TP. HCM.
3.4. Phƣơng pháp thí nghiệm
3.4.1 Khảo sát ảnh hƣởng của dịch chiết nấm Phytophthora đến khả năng hình thành chồi từ mô sẹo tiêu
3.4.1.1 Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro
Tiến hành thí nghiệm
Sử dụng môi trƣờng nuôi cấy tạo mô sẹo từ lá cây tiêu là môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D và 3mg/L BA.
Quá trình hình thành mô sẹo sẽ xày ra trong bóng tối, và mô sẹo sẽ hình thành từ những vết vết thƣơng trong quá trình cắt mẫu lá.
Sử dụng cây tiêu nuôi cấy in vitro, lấy mẫu lá cắt nhỏ thành những mẫu nhỏ (0.4 x 0.4cm). Đặt vào môi trƣờng, đặt mặt dƣới lá ở phía dƣới tiếp xúc với môi trƣờng. Mỗi chai cấy 6-7 mẫu lá nhỏ, thực hiện cấy 20 chai. Sau đó để vào trong bóng tối trong 2 tuần, khi từ những vết cắt bắt đầu xuất hiện sự hình thành mô sẹo. Sau đó lấy ra để ngoài ánh sáng nhẹ (50µmol/m2/s) 3 tuần để mô sẹo tiếp tục phát triển.
Lấy mô sẹo để tiến hành thí nghiệm. Điều kiện thí nghiệm
Mẫu đƣợc nuôi trên môi trƣờng: khoáng MS + 8,5g/L Agar + 30g/L Đƣờng saccharose + 1mg/L 2,4D + 3mg/L BA. Môi trƣờng đã đƣợc khử trùng ở 1.2 atm, 121oC trong thời gian 25 phút
pH môi trƣờng: 5,8
Thể tích môi trƣờng: 30ml
Cƣờng độ ánh sáng: Tối hoàn toàn trong 2 tuần đầu, 3 tuần sau đó cƣờng độ ánh sáng là 50µmol/m2/s
Nhiệt độ: 25 ± 20C Ẩm độ: 65 ± 5%
Thời gian theo dõi thí nghiệm: 5 tuần
3.4.1.2 Nuôi cấy tạo dịch nấm Phytophthora
Tiến hành thí nghiệm
Giống nấmPhytophthora sử dụng trong thí nghiệm là giống nấm đã đƣợc phân lập tại Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật - Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Nấm Phytophthora đƣợc cấy và nuôi trong môi trƣờng PGA (môi trƣờng dinh dƣỡng cho nấm phát triển gồm: khoai tây, glucose và agar) 48 giờ. Sau đó đƣợc nuôi trong dung dịch nuôi cấy cà rốt 20%, để trong bóng tối từ 48-72 giờ. Rửa sạch và tiếp tục nuôi ngoài sáng trong nƣớc cất trong 3-4 ngày.
Lọc nấm bằng vải lọc lấy dịch nuôi cấy nấm để tiến hành thí nghiệm. Điều kiện thí nghiệm
Nấm đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng PGA: môi trƣờng gồm khoai tây, glucose và agar khử trùng ở 1.2 atm, 121oC trong thời gian 25 phút
Thể tích môi trƣờng: 10ml Nhiệt độ: nhiệt độ phòng Ẩm độ: 65 ± 5%
Thời gian theo dõi thí nghiệm: 10 ngày
3.4.2.3 Thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu cấy mô sẹo cây tiêu
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm thực hiện với môi trƣờng nuôi cấy là môi trƣờng MS có bổ sung thêm 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA nồng độ dịch nấm.
Nồng độ dịch nấm với 4 mức độ:0%, 5%, 10%, 20% và vô trùng bằng hai cách là: hấp khử trùng ở 1,2 atm, 1210C trong 25 phút bằng autoclave và lọc vô trùng bằng màng lọc có kích thƣớc 0.45 m.
Thí nghiệm gồm 7 nghiệm thức đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 15 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức gồm 1 chai, và mỗi chai gồm 2 mẫu mô sẹo.
Tổng số chai: 105
Tổng số mẫu của mỗi nghiệm thức: 30 Tổng số mẫu của thí nghiệm: 210 Tiến hành thí nghiệm
Ta sử dụng mô sẹo đã tạo ra ở thí nghiệm 1 để tiến hành thi nghiệm.
Lấy mô sẹo cấy vào môi trƣờng đã chuẩn bị sẵn. Các thao tác chuẩn bị này đƣợc tiến hành trong điều kiện hoàn toàn vô trùng.
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu
Phƣơng pháp vô trùng Nghiệm thức Nồng độ dịch nấm (%) Số chai Số mẫu/chai Tổng số mẫu DC 0 15 2 30 Hấp khử trùng CC 5 15 2 30 CB 10 15 2 30 CA 20 15 2 30 Lọc vô trùng KC 5 15 2 30 KB 10 15 2 30 KA 20 15 2 30 Ghi chú: DC: đối chứng có nồng độ dịch nấm là 0%, CC: nồng độ dịch nấm 5% có hấp khử trùng, CB: nồng độ dịch nấm 10% có hấp khử trùng, CA: nồng độ dịch nấm 20% có hấp khử trùng, KC: nồng độ dịch nấm 5% lọc vô trùng, KB: nồng độ dịch nấm 10% lọc vô trùng, KA: nồng độ dịch nấm 20% lọc vô trùng.
Điều kiện thí nghiệm:
Môi trƣờng: Các mẫu mô sẹo đƣợc nuôi trên môi trƣờng khoáng MS + 7,5g/L Agar + 30g/L Đƣờng saccharose + 3mg/L BA + 1mg/L TDZ với sự thay đổi về nồng độ của dịch nấm, môi trƣờng đƣợc khử trùng ở 1,2 atm, 1210C trong 25 phút
pH môi trƣờng: 5,8
Thể tích môi trƣờng: 30ml / bình 250ml Cƣờng độ ánh sáng: 50µmol/m2
/s Thời gian chiếu sáng: 16 giờ / ngày Nhiệt độ nuôi: 25 ± 20C
Ẩm độ: 65 ± 5%
Thời gian thí nghiệm là 90 ngày Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm:
Số chồi hình thành ở mỗi chai. Sự thay đổi màu sắc của môi trƣờng
Khả năng phát triển mô sẹo ở mỗi nghiệm thức
Trọng lƣợng tƣơi mô sẹo: Cân lần lƣợt các mô sẹo của từng nghiệm thức bằng cân phân tích trong điều kiện hoàn toàn vô trùng
Hệ số tăng trƣởng của mô sẹo:
HSTTMS = Ln(ms) – Ln(mt) / số ngày theo dõi mt: trọng lƣợng của mô sẹo khi cấy
ms: trọng lƣợng của mô sẹo khi kết thúc thí nghiệm
3.4.4 Nhuộm mẫu mô sẹo tiêu và xem kết quả dƣới kính hiển vi
Sau 10 tuần nuôi cấy, tiến hành cắt lát mỏng mô sẹo, nhuộm mẫu và xem kết quả dƣới kính hiển vi với nhiều vật kính khác nhau.
Nhuộm mẫu bằng phẩm nhuộm hai màu là dung dịch gồm hai thứ phẩm nhuộm: - Phẩm đỏ Carmin sẽ nhuộm màu hồng lạt hay tím lạt nếu màng tế bào bằng chất cellulose pectic.
- Phẩm xanh lục vert d’iod sẽ nhuộm màu xanh lục nếu màng tế bào bằng chất gỗ (ligin) hay bần (suberin).
Quy trình nhuộm:
- Cắt lát mỏng mô sẹo
- Ngâm trong nƣớc Javel trong 15 phút để loại nội dung tế bào - Rửa nƣớc cho sạch Javel
- Ngâm mẫu trong acid acetic trong 5 phút để loại Javel còn lại - Rửa nƣớc cho sạch acid acetic
- Nhuộm bằng phẩm nhuộm hai màu trong 3 phút - Rửa nƣớc cho sạch phẩm thừa
Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm
Xem và so sánh sự khác biệt (hình dạng, kích thƣớc…) giữa các mẫu của các nghiệm thức khác nhau.
3.5 Phân tích thống kê
Hình 4.1 Sự hình thành mô sẹo từ lá cây tiêu trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4D và 3mg/L BA
(A) sau 2 tuần nuôi cấy trong tối; (B) tiếp tục nuôi cấy ở cường độ ánh sáng 50µmol/m2
/s.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Thí nghiệm : Ảnh hƣởng của dịch chiết nấm Phytophthora đến khả nằng hình thành chồi từ mô sẹo tiêu thành chồi từ mô sẹo tiêu
4.1.1 Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro
Sau 2 tuần nuôi cấy trong bóng tối tại những vết cắt (ở mép lá) bắt đầu xuất hiện những vết sần, là dấu hiệu mô sẹo bắt đầu hình thành.
Sau 3 tuần tiếp tục phát triển ở điều kiện chiếu sáng (cƣờng độ ánh sáng 50µmol/m2/s), mô sẹo đã phát triển ở toàn bộ mẫu lá.
4.1.2 Thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu
Quá trình theo dõi thí nghiệm chúng tôi nhận thấy sự tái sinh chồi của các nghiệm thức khác so với nghiệm thức không chủng dịch nấm trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo tiêu có một số đặc điểm sau:
- Khả năng bật chồi kém.
- Số chồi rất ít (chỉ 1 – 2 chồi trên mỗi cụm mô).
- Chồi có màu hơi tái, chồi hình thành đơn lẻ, chỉ có một đến hai chồi có khả năng phát triển. Điều này cho thấy sự khác biệt rất lớn nếu so sánh với số chồi hình thành trên nghiệm thức không chủng dịch nấm trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo.
Bảng 4.1 Kết quả tái sinh chồi và hệ số tăng trƣởng mô sẹo sau 90 ngày cấy Phƣơng pháp vô trùng Nghiệm thức Nông độ dịch nấm (%) Số chồi HSTTMS (g/ngày) Hệ số nhân chồi (chồi/tháng) DC 0 2,10a 0,0173 0,68a Hấp khử trùng CC 5 0,87b 0,0151 0,28 b CB 10 0,33b 0,0153 0,11b CA 20 0,67b 0,0141 0,22b Lọc vô trùng KC 5 1,27ab 0,0152 0,42a KB 10 0,80b 0,0154 0,26b KA 20 0,93b 0,0155 0,31b Ghi chú: DC: đối chứng có nồng độ dịch nấm là 0%; CC: nồng độ dịch nấm 5% có hấp khử trùng; CB: nồng độ dịch nấm 10% có hấp khử trùng; CA: nồng độ dịch nấm 20% có hấp khử trùng; KC: nồng độ dịch nấm 5% lọc vô trùng; KB: nồng độ dịch nấm 10% lọc vô trùng; KA: nồng độ dịch nấm 20% lọc vô trùng; HSTTMS: hệ số tăng trưởng của mô sẹo
Các ký tự giống nhau theo sau các chữ số trong cùng một cột thì không có sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 0,01< P ≤ 0,05.
Kết quả của Bảng 4.1 cho thấy có một sự khác biệt có ý nghĩa về khả năng tái sinh chồi của nghiệm thức không chủng dịch nấm và nghiệm thức có chủng dịch nấm với nồng độ 10% vô trùng dịch nấm bằng màng có kích thƣớc 0,45μm so với các nghiệm thức còn lại. Trong đó, nghiệm thức không chủng dịch nấm cho kết quả tái sinh chồi cao nhất (2,1 chồi/chai). Kết quả này cho thấy rằng dịch nấm đã có những ảnh hƣởng nhất định đến khả năng bật chồi của mô sẹo, nó làm ức chế khả năng tái sinh chồi của mẫu mô.
Kết quả Bảng 4.1 cho thấy là không có sự khác biệt có ý nghĩa trong quá trình tăng trƣởng mô sẹo. Tuy nhiên hệ số tăng sinh mô sẹo của nghiệm thức không chủng dịch nấm là cao nhất (0,0173g/ngày). Nó cho thấy rằng dịch nấm không có ảnh hƣởng rõ rệt tới khả năng tăng trƣởng của mô sẹo.
Sau 6 tuần nuôi cấy, chúng tôi nhận thấy rằng những cụm mô sẹo của những nghiệm thức có chủng dịch nấm đã có sự biến đổi. phần mô sẹo tiếp xúc với môi trƣờng có dấu hiệu bị đen, và phần môi trƣờng nuôi cấy xung quanh cũng chuyển
thành màu đen hơn. Thông thƣờng hiện tƣợng đen của mô sẹo và sự thay đổi màu (bị đen) của môi trƣờng có thể là do hết chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng nuôi cấy hay là do nuôi cấy mô sẹo dƣới cƣờng độ ánh sáng cao. Ở đây cả hai nguyên nhân trên đều không phải vì thời gian nuôi cấy chỉ mới 6 tuần (sau khi nuôi cấy khoảng 10 tuần thì dinh dƣỡng trong môi trƣờng mới bắt đầu hết) và điều kiện chiếu sáng vào khoảng 50µmol/m2.s (cƣờng độ ánh sáng khá yếu). Mặt khác, ở cùng điều kiện thì ở nghiệm thức không có bổ sung dịch nấm thì hiện tƣợng mô sẹo bị đen và môi trƣờng chuyển màu không xảy ra. Có thể kết luận hiện tƣợng trên là do dịch nấm bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy đã ảnh hƣởng đến quá trình phát triển của mô sẹo.
Dịch nuôi cấy nấm Phytophthora chứa các trao đổi chất của nấm Phytophthora, các hợp chất đó bao gồm các độc tố của loại nấm này đối với ký chủ của loại nấm này. Nhƣ ta biết mô sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức, các tế bào mô sẹo phân chia liên tục, đặc biệt ở các tế bào còn non hiện tƣợng phân chia tế bào rất mạnh mẽ. Trong quá trình phân chia tế bào sẽ làm cho cấu trúc tế bào kém ổn định. Rất có thể độc tố nấm có trong dịch nấm đã tác động và làm ảnh hƣởng tới quá trình phân bào của mô sẹo. Có thể các tế bào tiếp xúc với môi trƣờng bị đen (các tế bào chết) là do các tế bào này đã tiếp xúc và chịu ảnh hƣởng trực tiếp từ dịch nấm.
Vậy thì có hay không có các phản ứng của tế bào mô sẹo đối với độc tố của nấm? Các tế bào mô sẹo sẽ có các phản ứng để chống lại với sự ảnh hƣởng của độc tố nấm. Tế bào sẽ sản sinh ra những chất để chống lại độc tố của nấm. Cơ chế phòng vệ của tế bào mô sẹo có thể là do 2 cơ chế: (1) các chất chống lại tác động của độc tố nấm là do các phản ứng sinh hóa phòng vệ của tế bào để chống chịu lại với các điều kiện bất lợi; (2) các chất chống lại tác động của độc tố nấm đƣợc sinh ra là do sự điều khiển của một gene nào đó. Sự tác động của độc tố nấm lên quá trình phân chia tế bào có thể
tạo ra một đột biến giúp tế bào có khả năng chống chịu với độc tố nấm. Kết quả thu đƣợc qua thí nghiệm cho thấy rằng với phƣơng pháp vô trùng bằng
cách sử dụng đầu lọc kích thƣớc 0,45µm cho kết quả tái sinh chồi cao hơn so với phƣơng pháp hấp khử trùng ở 121oC trong 25 phút. Có thể ở nhiệt độ cao dịch nấm có thể bị phân hủy tạo thành những chất ức chế sự tái sinh chồi từ mô sẹo, hay nhiệt độ đã làm giảm tính độc của độc tố nấm.
Hình 4.2: Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D và 3mg/L BA sau 90 ngày nuôi cấy.
Hình 4.3 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA và 5% dịch nấm, hấp khử trùng sau 90 ngày nuôi cấy.
Hình 4.5 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA và 20% dịch nấm, hấp khử trùng sau 90 ngày nuôi cấy. Hình 4.4 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA và 10% dịch nấm, hấp khử trùng sau 90 ngày nuôi cấy.
Hình 4.6 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA và 5% dịch nấm, lọc vô trùng sau 90 ngày nuôi cấy.
Hình 4.7 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA và 10% dịch nấm, lọc vô trùng sau 90 ngày nuôi cấy.
4.3 Nhuộm mẫu mô sẹo tiêu sau 10 tuần nuôi cấy
Sau 10 tuần nuôi cấy, tiến hành cắt mẫu nhuộm phần mô sẹo trên (phần nằm trên môi trƣờng có màu xanh, trắng hay vàng xám) và phần mô sẹo dƣới (phần tiếp xúc với môi trƣờng). Kết quả nhuộm mẫu cho thấy:
Phần mô sẹo nằm trên môi trƣờng của tất cả các nghiệm thức đều cho kết quả nhuộm mẫu giống nhau. Các tế bào xếp sát nhau, hƣớng tâm (hƣớng về phần lõi trong của mẫu mô).
Phần mô sẹo nằm dƣới môi trƣờng của nghiệm thức không chủng dịch nấm trong môi trƣờng nuôi cấy có kết quả nhuộm mẫu giống với phần mô sẹo nằm trên môi trƣờng.
Kết quả nhuộm mẫu của phần dƣới của các nghiệm thức có chủng dịch nấm cho kết quả khác biệt so với kết quả nhuộm mẫu của nghiệm thức không chủng dịch nấm. Các tế bào sắp xếp thƣa hơn, và kích thƣớc tế bào cũng lớn hơn so với các tế bào phần trên và phần dƣới mô sẹo của nghiệm thức không chủng dịch nấm.
Hình 4.8 Chồi tiêu hình thành từ mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 1mg/L 2,4-D, 3mg/L BA và 20% dịch nấm, lọc vô trùng sau 90 ngày nuôi cấy.
Hình 4.10 Mặt cắt mặt dƣới mô sẹo cây tiêu nuôi